Base structurelle de la perception odorante des amines par un récepteur olfactif de mammifère | Shijiazhuang Agile Peak Ventures Co., Ltd.

Nature volume 618, pages 193–200 (2023)Citer cet article

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Les odorants sont détectés sous forme d'odeur dans l'épithélium nasal des mammifères par deux familles de récepteurs couplés aux protéines G, les récepteurs odorants et les récepteurs associés aux traces d'amines1,2 (TAAR). Les TAAR ont émergé suite à la divergence des poissons à mâchoires et sans mâchoires et comprennent une grande famille monophylétique de récepteurs qui reconnaissent les odorants d'amines volatiles pour susciter des comportements innés intraspécifiques et interspécifiques tels que l'attraction et l'aversion3,4,5. Nous rapportons ici les structures de cryo-microscopie électronique des trimères de souris TAAR9 (mTAAR9) et mTAAR9 – Gs ou mTAAR9 – Golf en complexe avec la β-phényléthylamine, la N, N-diméthylcyclohexylamine ou la spermidine. Les structures mTAAR9 contiennent une poche de liaison au ligand profonde et serrée décorée d'un motif D3.32W6.48Y7.43 conservé, qui est essentiel pour la reconnaissance des odorants amines. Dans la structure mTAAR9, une liaison disulfure unique reliant l'extrémité N-terminale à ECL2 est nécessaire pour l'activation du récepteur induite par l'agoniste. Nous identifions les motifs structurels clés des membres de la famille TAAR pour détecter les monoamines et les polyamines et la séquence partagée des différents membres TAAR qui sont responsables de la reconnaissance de la même odeur chimique. Nous élucidons la base moléculaire du couplage de mTAAR9 à Gs et Golf par caractérisation structurelle et analyse mutationnelle. Collectivement, nos résultats fournissent une base structurelle pour la détection des odeurs, l'activation des récepteurs et le couplage Golf d'un récepteur olfactif d'amine.

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Toutes les données produites ou analysées dans cette étude sont incluses dans le texte principal ou les documents supplémentaires. Les cartes de densité cryo-EM et les coordonnées atomiques ont été déposées à la banque de données de microscopie électronique sous les codes d'accession EMD-35762 (complexe SPE–mTAAR9–Gs), EMD-35763 (complexe PEA–mTAAR9–Gs), EMD-35705 (DMCHA –complexe mTAAR9–Gs), EMD-35764 (complexe CAD–mTAAR9–Gs), EMD-35761 (complexe PEA–mTAAR9–Golf), EMD-35765 (raffinement local pour le complexe SPE–mTAAR9) et EMD-35771 (complexe local raffinement pour PEA–mTAAR9 dans le complexe PEA–mTAAR9–Gs) et Protein Data Bank sous les codes d'accession 8IW4 (complexe SPE–mTAAR9–Gs), 8IW7 (complexe PEA–mTAAR9–Gs), 8ITF (complexe DMCHA–mTAAR9–Gs ), 8IW9 (complexe CAD–mTAAR9–Gs), 8IW1 (complexe PEA–mTAAR9–Golf), 8IWE (raffinement local pour le complexe SPE–mTAAR9) et 8IWM (raffinement local pour PEA–mTAAR9 dans le complexe PEA–mTAAR9–Gs ). Toutes les autres données sont disponibles sur demande auprès des auteurs correspondants.

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Ce travail a été soutenu par le National Key R&D Program of China (2022YFC2702600 à FY, 2018YFC1003600 à XY et J.-PS, 2019YFA0904200 à J.-PS, 2021ZD0203100 à Q. Li et 2022YFA1104003 à YX), National Science Fund for Distinguished Young Scholar s Grant (81825022 à J.-PS), National Science Fund for Excellent Young Scholars (82122070 à FY et 32122038 à QL), National Natural Science Foundation of China (81773704 à J.-PS et 92057121 à XY), le Key Research Project de la Beijing Natural Science Foundation, Chine (Z200019 à J.-PS), Major Fundamental Research Program of Natural Science Foundation of Shandong Province, China (ZR2021ZD18 à XY et ZR2020MH132 à S. Liu), le projet de recherche fondamentale de la Science and Commission technologique de la municipalité de Shanghai (21JC1404500 à QL), projet clé de recherche et développement de la province du Shandong (2021CXGC011105 à YX) et programme Shuguang soutenu par la Shanghai Education Development Foundation et la Shanghai Municipal Education Commission (21SG16 à QL). Les simulations moléculaires ont été réalisées sur la plateforme HPC Cloud de l'Université du Shandong. Nous remercions Y. Yin et W. Shui pour la collecte de données. SDL est chercheur au Howard Hughes Medical Institute.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Lulu Guo, Jie Cheng, Shuo Lian, Qun Liu, Yan Lu, Yuan Zheng, Kongkai Zhu

Institut de recherche médicale avancée, Parc de recherche translationnelle du lac Meili, Cheeloo College of Medicine, Université du Shandong, Jinan, Chine

Lulu Guo, Jie Cheng, Kongkai Zhu, Xiang Han, Shangming Liu, Fan Yang et Jin-Peng Sun

Département de biochimie et de biologie moléculaire, École de médecine de l'Université du Shandong, Jinan, Chine

Lulu Guo, Qun Liu, Yan Lu, Chao Zhang, Naikang Rong, Yuming Zhuang, Guoxing Fang, Jingjing Jiang, Tianyao Zhang, Xiang Han, Zili Liu, Fan Yang et Jin-Peng Sun

Key Laboratory Experimental Teratology of the Ministry of Education and Department of Physiology, School of Basic Medical Sciences, Shandong University, Jinan, China

Jie Cheng et Xiao Yu

Département de physiologie et physiopathologie, École des sciences médicales fondamentales, Université de Pékin, Laboratoire clé des sciences cardiovasculaires moléculaires, Ministère de l'éducation, Pékin, Chine

Jie Cheng, Yuan Zheng et Jin Peng Sun

Département de chirurgie générale, Hôpital Qilu de l'Université du Shandong, Jinan, Chine

Shuo Lian, Minghui Zhang et Yunfei Xu

Institut Songjiang et hôpital Songjiang, École de médecine de l'Université Jiao Tong de Shanghai, Shanghai, Chine

Yalei Kong et Qian Li

Center for Brain Science, Shanghai Children's Medical Center, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, Chine

Yalei Kong et Qian Li

Département d'anatomie et de physiologie, Ministère de l'éducation-Shanghai Laboratoire clé de la santé environnementale des enfants à l'hôpital Xinhua, École de médecine de l'Université Jiao Tong de Shanghai, Shanghai, Chine

Yalei Kong et Qian Li

Département d'oto-rhino-laryngologie, hôpital provincial du Shandong affilié à la première université médicale du Shandong, Shandong, Chine

Ming Xia

MOE Key Laboratory for Nonequilibrium Synthesis and Modulation of Condensed Matter, École de physique, Université Xi'an Jiaotong, Xi'an, Chine

Lei Zhang

Howard Hughes Medical Institute, Département de biologie cellulaire, Harvard Medical School, Boston, MA, États-Unis

Stephen D. Liberles

Centre de recherche de Shanghai sur les sciences du cerveau et l'intelligence inspirée par le cerveau, Shanghai, Chine

Qian Li

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J.-PS et Q. Li ont initié l'étude des récepteurs olfactifs TAAR. J.-PS, YX et FY ont organisé le projet. J.-PS, XY et FY ont conçu et supervisé la conception et l'exécution expérimentales globales. J.-PS, YX, FY, LG et JC ont participé à l'analyse et à l'interprétation des données. J.-PS et FY ont guidé toute l'analyse structurale. Q. Li et SDL ont fourni des plasmides TAAR originaux et modifiés et organisé des expériences fonctionnelles avec J.-PS, XY et FYLG et Q. Liu ont conçu et exécuté le criblage des récepteurs pour les études structurelles. YK, LG, Q. Liu et Q. Li ont généré la construction d'expression de cellules d'insectes mTAAR9. LG, Y. Zheng et YX ont établi les protocoles de purification complexes PEA–mTAAR–Gs–scFv16, SPE–mTAAR–Gs–scFv16 et PEA–mTAAR9–Golf–scFv16 et préparé des échantillons pour cryo-EM. JC, S. Lian et YL ont généré des constructions et des mutants mTAAR9 pour les tests d'activité de la protéine G à base de cellules. JC, S. Lian, XH, S. Liu et YL ont conçu des mutants de poche de liaison de ligand et d'interaction de protéine G. JC, S. Lian, XY et YL ont établi le test de dissociation Golf – Gβγ. YL a effectué le test de spectrométrie de masse. KZ a construit les modes de liaison de l'octanal et du propionate dans la poche de ligand des récepteurs odorants rapportés correspondants Olfr2 et Olfr78. KKZ et MZ ont effectué des simulations de dynamique moléculaire pour les ligands au sein des structures complexes mTAAR9. CZ a effectué des simulations de dynamique moléculaire pour le modèle apo-mTAAR9 et le modèle PEA – mTAAR9 – Gαsβ1γ13. LG, MZ, NR, JJ, Q. Liu, TZ, GF, Y. Zhuang, LZ et Y. Zheng ont préparé les grilles cryo-EM, collecté les données cryo-EM pour le SPE–mTAAR9–Gs–scFv16, PEA– complexes mTAAR9–Gs–scFv16, PEA–mTAAR9–Golf–scFv16, DMCHA–mTAAR9–Gs–scFv16 et CAD–mTAAR9–Gs–scFv16. J.-PS a rédigé le manuscrit initial. FY, Q. Li, LG, MX et XY ont fourni des discussions importantes et des révisions essentielles. Y. Zheng et JC ont fourni les Fig. 1a–c. FY, LG, YL, MX et YX ont fourni les Fig. 1–5. FY, JC, LG, S. Lian et MZ ont fourni des données détaillées.

Correspondance à Yunfei Xu, Fan Yang, Qian Li ou Jin-Peng Sun.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature remercie le(s) relecteur(s) anonyme(s) pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail. Des rapports d'examen par les pairs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

a, Les niveaux de protéines des récepteurs TAAR dans la fraction membranaire plasmique, y compris 6 hTAAR, 13 mTAAR et 16 rTAAR qui ont été surexprimés dans les lignées cellulaires Sf9 à l'aide d'un système d'expression de baculovirus Bac-to-Bac® (Invitrogen). Les données sont représentées sous forme de moyenne ± SEM à partir de 3 expériences indépendantes (n = 3). be, La plupart des récepteurs olfactifs, y compris les TAAR, sont bien connus pour leurs très faibles niveaux d'expression en utilisant des systèmes d'expression hétérologues, soit dans des cellules baculovirus-insectes, soit dans des cellules HEK293 de mammifères. dont 6 chez l'homme (hTAARs), 13 chez la souris (mTAARs, sauf mTAAR8b et mTAAR8c) et 16 chez le rat (rTAARs, sauf rTAAR8a), en utilisant des cellules d'insectes Spodoptera frugiperda (Sf9) et le système de baculovirus Bac-to-Bac® (Invitrogen) . Notamment, seuls mTAAR1, mTAAR9, rTAAR7d, hTAAR5 et hTAAR6 ont été détectés sur la membrane plasmique, avec des rendements allant d'environ 0,11 à 0,21 mg/L. f, Profils représentatifs d'élution par chromatographie d'exclusion de taille des complexes mTAAR9-Golf, mTAAR1-Golf, rTAAR7d-Golf, hTAAR6-Golf et hTAAR5-Golf purifiés à l'aide de Superose 6 Augmentation 10/300 GL. La chromatographie d'exclusion de taille a montré que seul mTAAR9 générait des complexes homogènes et stables avec le trimère Golf (Gβ1-Gγ2), alors que les 4 autres complexes TAAR-Gαolf-Gβ1-Gγ2 et TAAR en complexe avec Gαolf-Gβ1-Gγ13 étaient instables et subissaient souvent une constante dissociation. Les pics de chromatographie d'exclusion de taille sont marqués par des triangles. g, Profils représentatifs d'élution par chromatographie d'exclusion de taille des complexes mTAAR9-Gs, mTAAR1-Gs, rTAAR7d-Gs, hTAAR6-Gs et hTAAR5-Gs purifiés à l'aide de Superose 6 Augmentation 10/300 GL. La chromatographie d'exclusion de taille a montré que seuls mTAAR9 et mTAAR1 généraient des complexes homogènes et stables avec le trimère Gs (Gβ1-Gγ2), alors que les 3 autres complexes TAAR-Gs étaient instables et subissaient souvent une dissociation constante. Les pics de chromatographie d'exclusion de taille sont marqués par des triangles.

a, La puissance et l'efficacité de la dissociation Gα (y compris Golf, Gs, Gi1-3, Go et Gq) -Gβγ en réponse à la stimulation avec différents agonistes dans les cellules HEK293 surexprimant mTAAR9. La carte thermique est colorée en fonction de la valeur de pEC50 et Emax. ND, signal non détectable. Les valeurs ont été moyennées à partir de 3 expériences indépendantes pour mTAAR9 (n = 3). Abréviations : SPE, spermidine ; T1AM, 3-iodothyronamine ; DMCHA, N,N-diméthylcyclohexylamine; IAA, isoamylamine; IBA, isobutylamine; TMA, triméthylamine; CHA, cyclohexylamine; 1-MPD, 1-méthylpipéridine ; PEA, β-phényléthylamine; CAD, cadavérine ; PTC, putrescine. b, Courbes dose-réponse de la dissociation Gα (y compris Golf, Gs, Gi1-3, Go et Gq)-Gβγ dans les cellules HEK293 surexprimant mTAAR9 en réponse à la stimulation avec différents agonistes odorants (SPE, SEP-363856, T1AM, DMCHA, IAA, IBA, TMA, CHA, 1-MPD, PEA, CAD et PTC). Les valeurs sont représentées sous forme de moyenne ± SEM de 3 expériences indépendantes (n = 3).

ad, les courbes dose-réponse de SPE ( a ), DMCHA ( b ), PEA ( c ) et CAD ( d ) ont induit la dissociation Gαs-Gβγ dans les cellules surexprimant mTAAR9 ou BRIL-mTAAR9. Les valeurs sont représentées sous forme de moyenne ± SEM de 3 expériences indépendantes (n = 3). Pour augmenter l'expression du récepteur, le cytochrome b562RIL (BRIL) thermostabilisé a été incorporé à l'extrémité N-terminale du mTAAR9 de pleine longueur, et la protéine chimérique s'est avérée présenter une activité de couplage de la protéine G similaire à celle du mTAAR9 de type sauvage. eh, les courbes dose-réponse de SPE (e), DMCHA (f), PEA (g) et CAD (h) ont induit la dissociation Gαs-Gβγ ou modifiée Gαs (modGαs)-Gβγ dans les cellules surexprimant mTAAR9. Les valeurs sont représentées sous forme de moyenne ± SEM de 3 expériences indépendantes (n = 3). Une chimère Gαs modifiée (modGαs) a été générée sur la base de l'échafaudage mini-Gs avec remplacement de l'extrémité N-terminale de Gs (résidu 1 au résidu 25) par Gαi1 (résidu 1 au résidu 18) pour faciliter la liaison de scFv16 et remplacer le lieur GGSGGSGG à la position du domaine α-hélicoïdal Gαs d'origine (AHD, V65-L203) avec celui de Gi1 humain (G60-K180). Dans les cellules HEK293, la chimère modGαs a un profil pharmacologique similaire dans le test de dissociation des protéines G en aval de l'activation de mTAAR9 en réponse à des stimulations de SPE, DMCHA, PEA ou CAD. il, Courbes dose-réponse de SPE (i), DMCHA (j), PEA (k) et CAD (l) induites par la dissociation Gαolf-Gβγ ou modifiée Gαolf (modGαolf)-Gβγ dans les cellules surexprimant mTAAR9. Les valeurs sont représentées sous forme de moyenne ± SEM de 3 expériences indépendantes (n = 3). Une chimère Gαolf modifiée a été générée sur la base de l'échafaudage mini-Golf avec remplacement de l'extrémité N-terminale de Golf (résidu 1 au résidu 27) par Gαi1 (résidu 1 au résidu 18) pour faciliter la liaison de scFv16. Le modGαolf a été exprimé et purifié dans des cellules d'insectes pour stabiliser les complexes mTAAR9 pour l'étude cryo-EM. Dans les cellules HEK293, la chimère Gαolf modifiée a un profil pharmacologique similaire dans le test de dissociation des protéines G en aval de l'activation de mTAAR9 en réponse à SPE, DMCHA, PEA ou CAD. mq, Profils d'élution représentatifs du complexe SPE–mTAAR9–Gs–scFv16 reconstitué in vitro (m), complexe PEA–mTAAR9–Gs–scFv16 (n), complexe PEA–mTAAR9–Golf–scFv16 (o), DMCHA–mTAAR9–Gs complexe –scFv16 (p) et complexe CAD–mTAAR9–Gs–scFv16 (q). sur la colonne Superose 6 Augmentation 10/300 et les résultats SDS-PAGE représentatifs des pics de chromatographie d'exclusion de taille.

a, micrographie représentative Cryo-EM et moyennes de classe bidimensionnelle (2D) des particules SPE-mTAAR9-Gs (barre d'échelle : 100 nm). Une micrographie Cryo-EM représentative de 7132 films et des moyennes de classes bidimensionnelles représentatives déterminées à l'aide d'environ 193217 particules après classification 3D ont été présentées. b, organigramme pour la classification tridimensionnelle (3D) des particules SPE-mTAAR9-Gs. Des micrographies Cryo-EM représentatives de 7 132 films et des moyennes de classe 2D représentatives déterminées à l'aide d'environ 193 217 particules après classification 3D sont présentées. Nous avons réalisé un masque pour le récepteur seul pour les structures complexes SPE-mTAAR9-Gs. Le résultat a indiqué que le masque de la région réceptrice dans les complexes SPE-mTAAR9-Gs améliorait considérablement la qualité de la carte de la région spécifique de mTAAR9. c, Courbes de corrélation en coquille de Fourier pour la carte de densité 3D finale des particules SPE-mTAAR9-Gs. Au seuil FSC 0,143, la résolution globale de la carte est de 3,5 Å. d, carte de densité 3D colorée selon la résolution locale (Å) du complexe trimère SPE-mTAAR9-Gs. e, micrographie représentative Cryo-EM et moyennes de classe 2D des particules PEA-mTAAR9-Gs (barre d'échelle : 100 nm). Une micrographie Cryo-EM représentative de 8025 films et des moyennes de classes bidimensionnelles représentatives déterminées à l'aide d'environ 463012 particules après classification 3D ont été présentées. f, organigramme pour la classification 3D des particules PEA-mTAAR9-Gs. Des micrographies Cryo-EM représentatives de 8 025 films et des moyennes de classe 2D représentatives déterminées à l'aide d'environ 463 012 particules après classification 3D sont présentées. Nous avons réalisé un masque pour le récepteur seul pour les structures complexes PEA-mTAAR9-Gs. Le résultat a indiqué que le masque de la région du récepteur dans les complexes PEA-mTAAR9-Gs améliorait considérablement la qualité de la carte de la région spécifique de mTAAR9. g, Courbes de corrélation de la coquille de Fourier pour la carte de densité 3D finale des particules PEA-mTAAR9-Gs. Au seuil de coupure FSC 0,143, la résolution globale de la carte est de 3,0 Å. h, carte de densité 3D colorée selon la résolution locale (Å) du complexe trimère PEA-mTAAR9-Gs. i, Représentation tridimensionnelle (3D) de l'extrémité N-terminale, ECL1 et ECL2 de mTAAR9 dans le complexe CAD-mTAAR9-Gs, Olfr78 (prédit par AlphaFold 2), β2AR (APB : 3SN6) et D1R (APB : 7X2F). La densité électronique ou la densité EM de l'extrémité N-terminale ne sont pas observées dans la structure cristalline du complexe β2AR-Gs et dans la structure EM du complexe D1R. Les N-terminaux de β2AR et D1R sont supposés désordonnés. Dans la structure Olfr78 prédite par Alphafold2, l'extrémité N-terminale est insérée entre ECL1 et ECL2. En revanche, l'extrémité N-terminale de mTAAR9 traverse l'ECL1 et atteint la pointe de l'ECL2.

ac, les cartes et les modèles de densité Cryo-EM sont présentés pour TM1, TM2, TM3, TM4, TM5, TM6, TM7 de mTAAR9 et l'hélice α5 de Gαs/Gαolf dans le complexe SPE-mTAAR9-Gs en utilisant la carte globale de SPE-mTAAR9 -Gs complexe avec seuil de carte à 0,0255 (a), dans le complexe PEA-mTAAR9-Gs en utilisant la carte globale du complexe PEA-mTAAR9-Gs avec seuil de carte à 0,0160 (b), dans le complexe PEA-mTAAR9-Golf en utilisant le carte globale du complexe PEA-mTAAR9-Golf avec seuil cartographique à 0,0600 (c). Lors de l'utilisation de l'outil "Zone de couleur" dans Chimera, nous définissons le rayon de couleur à 3 Å.

a, Résumé des analyses de la paire de liaisons disulfure C22Nter:C186ECL2 qui a été observée ou potentiellement observée dans la densité Cryo-EM et identifiée par spectrométrie de masse (MS). Cette liaison disulfure conservée a également été prédite par Alphafold2 pour la plupart des membres de TAAR, à l'exception de TAAR1. Bien que la densité EM des régions extracellulaires des TAAR ne soit pas assez bonne pour identifier les liaisons disulfure potentielles dans les structures PEA-mTAAR9-Gs et PEA-mTAAR9-Golf, nos données de spectrométrie de masse suggèrent que le complexe apo-mTAAR9, PEA-mTAAR9-Golf , PEA-, SPE-, DMCHA-mTAAR9-Gs et SPE-mTAAR5 ont tous ces liaisons disulfure conservées. Les densités potentielles de Cryo-EM pour la liaison disulfure de la paire C22Nter: C186ECL2 dans les structures SPE-mTAAR9-Gs et DMCHA-mTAAR9-Gs sont présentées dans la Fig. 9 supplémentaire. identification de la paire disulfure C22Nter:C186ECL2 dans le complexe PEA-mTAAR9-Gs (b) complexe SPE-mTAAR9-Gs (c), complexe DMCHA-mTAAR9-Gs (d), complexe PEA-mTAAR9-Golf(e), apo -mTAAR9 (g) et la paire de liaison disulfure C24Nter:C188ECL2 dans TMA-mTAAR5 (f) par MS. NEM, méthylmaléimide. h, Vue d'ensemble schématique de 3 modèles de disulfure (y compris la paire C22Nter: C186ECL2) d'apo-mTAAR9 prédit par AlphaFold2. i, Effets des mutations de résidus clés de la paire disulfure C14Nter: C97ECL1 et de la paire disulfure C22Nter: C186ECL2 de mTAAR9, mTAAR4, mTAAR5 et mTAAR8c sur les activités des récepteurs induites par leurs agonistes respectifs (SPE, PEA, TMA et 1-MPD). La heatmap est colorée en fonction de la valeur de ΔpEC50 (ΔpEC50 = pEC50 du mutant-pEC50 de type sauvage). ND, signal non détectable. Les valeurs ont été moyennées à partir de 3 expériences indépendantes (n = 3). jm, Courbes dose-réponse des mutations de résidus clés des paires disulfure, paire C14Nter: C97ECL1 et paire C22Nter: C186ECL2 de mTAAR9 sur leurs activités induites par SPE, CAD, PEA et DMCHA, respectivement. Les valeurs sont représentées sous forme de moyenne ± SEM de 3 expériences indépendantes (n = 3). np, Courbes dose-réponse des mutations clés des résidus des paires disulfure, paire C14Nter:C97ECL1 et paire C22Nter:C186ECL2 de mTAAR8c (n), mTAAR5 (o) et mTAAR4 (p) sur leurs activités induites par les agonistes respectifs (1-MPD , TMA et PEA). Les valeurs sont représentées sous forme de moyenne ± SEM de 3 expériences indépendantes (n = 3).

Les densités EM de SPE et DMCHA pourraient être positionnées dans 3 modes différents, et PEA dans 2 modes potentiels dans les structures complexes SPE-, DMCHA- et PEA-mTAAR9-Gs. Après des simulations de dynamique moléculaire (MD), un seul mode de PEA, SPE et DMCHA a été utilisé pour une analyse structurelle et des caractérisations biochimiques plus poussées (voir également les figures supplémentaires 11–12). Cependant, le mode de liaison CAD dans la poche de ligand mTAAR9 n'a pas pu être défini avec précision, dans lequel plusieurs conformations de CAD pourraient être adaptées à la densité EM actuelle. a, densité EM correspondant aux trois modes différents de SPE dans le complexe SPE-mTAAR9-Gs. Mode SPE 1 : vert, mode SPE 2 : orange, mode SPE 3 : bleu. b, représentation 3D des interactions détaillées entre SPE et mTAAR9 en mode 1, mode 2 et mode 3. Les liaisons hydrogène sont représentées par des lignes pointillées rouges. c, représentation par code-barres des modèles d'interaction dans trois modes de liaison de mTAAR9 liés par SPE. Les résidus qui interagissent avec le SPE sont indiqués dans des cercles verts, ceux qui interagissent uniquement en mode 1 ou en mode 2 sont indiqués dans des cercles bleu clair et ceux qui interagissent uniquement en mode 3 sont indiqués dans des cercles orange. d, La comparaison de la contribution de l'énergie de liaison des résidus du site de liaison de mTAAR9 dans les deux modes du complexe SPE-mTAAR9-Gs, telle que calculée par la méthode de mécanique moléculaire MM-PBSA57. Mode SPE 1 : vert, mode SPE 2 : orange. e, Effets des mutations des résidus en interaction dans trois modes de liaison SPE de mTAAR9 en réponse à la stimulation avec SPE. La carte thermique est colorée en fonction de la valeur de ΔpEC50. Les valeurs provenaient de 3 expériences indépendantes (n = 3). Les mutations des résidus qui interagissent en mode 1 mais pas en mode 3 sont représentées en fond bleu clair, et celles qui interagissent uniquement en mode 3 sont représentées en fond orange. f, La valeur RMSD moyenne de SPE et des résidus du site de liaison dans les trois modes du complexe SPE-mTAAR9-Gs lors de simulations MD triples de 200 ns. Notamment, le mode de liaison 1 et le mode 2 de SPE étaient très similaires, sauf que le N5 de SPE dans SPE-mTAAR9-G pouvait être positionné différemment, ce qui correspondait bien à la densité EM, potentiellement en raison de la configuration linéaire de SPE. Comparé à l'autre mode (mode 2), le mode de liaison avec SPE (mode 1) présentait une énergie plus faible lorsque le ligand était à proximité de F1173.37 et le milieu N5 était plus proche de Y2746.51. De plus, la mutation de F1173.37A a significativement diminué l'activation de mTAAR9 en réponse à la stimulation de SPE. Une analyse plus approfondie des contributions d'énergie de liaison de chaque résidu situé dans la poche de liaison par analyse MD a confirmé que le mode de liaison 1 présentait une plus grande stabilité que celle du mode 2. En mode 3, le SPE a perdu des interactions spécifiques avec le T1093.29, F1684. 61, W2716.48 et V3007.42, et a établi un nouveau contact avec Y2937.35. Notamment, bien que la mutation Y293A n'ait montré aucun effet significatif sur l'activation de mTAAR9 induite par SPE, les mutations de T1093.29A, F1684.61A, W2716.48A ou V3007.42A ont réduit de manière significative ou totalement aboli l'activation de mTAAR9 induite par SPE. De plus, la simulation MD a suggéré que le mode 3 est moins stable que le mode 1 et le mode 2. Nous avons donc principalement utilisé le mode 1 de SPE pour d'autres caractérisations biochimiques.

Nous avons utilisé AlphaFold2 pour prédire la structure des souris Olfr2 et Olfr78 et utilisé l'algorithme SiteMap pour prédire leurs poches de ligand correspondantes. Nous avons ensuite effectué un amarrage moléculaire et une simulation MD pour sonder davantage l'interaction entre l'octanal et le propionate dans les poches de ligand de leurs récepteurs odorants rapportés, respectivement Olfr2 et Olfr78. a, vue en coupe de la poche de liaison au ligand dans le complexe dopamine-D1R-Gs, (PDB: 7CKZ, à gauche), complexe Octanal-Olfr2 généré par AlphaFold2 et simulation MD (milieu) et MS47134-MRGPRX4-Gq (PDB :7S8P, à droite). b, Illustration des structures Olfr2 et Olfr78 prédites par AlphaFold2. c, Poches de liaison de ligand prédites dans Olfr2 (panneau de gauche) et Olfr78 (panneau de droite) déterminées à l'aide de l'algorithme SiteMap. Les poches de liaison prédites Olfr2 sont remplies de boules vertes, jaunes, orange, cyan ou bleues. Les poches de reliure prévues par Olfr78 sont remplies de boules rouges, vertes, roses, bleues ou cyan. d, La valeur RMSD moyenne de l'octanal (panneau supérieur) et des résidus clés dans Olfr2 qui interagissent directement avec l'octanal (panneau inférieur) pendant trois fois 200 ns de simulation MD. e, La valeur RMSD moyenne du propionate (panneau supérieur) et des résidus clés dans Olfr78 qui interagissent directement avec le propionate (panneau inférieur) pendant trois fois 200 ns de simulation MD. f, Comparaison structurelle de la poche de liaison de mTAAR9 avec la structure simulée de l'octanal-Olfr2 et du propionate Olfr78 de souris qui ont été générés par amarrage moléculaire basé sur les structures prédites AlphaFold2 d'Olfr2 et d'Olfr78. La poche de ligand des deux récepteurs odorants a été définie par 4 hélices, TM3-TM6. En revanche, la poche de ligands de mTAAR9 est définie par des TM7 supplémentaires, qui fournissent potentiellement plus d'interactions. Une autre différence notable est que les ligands de mTAAR9 se lient plus profondément que ceux des ligands prédits dans Olfr2 ou Olfr78, formant un contact direct avec le grand résidu hydrophobe W6.48. Dans Olfr2 ou Olfr78, le grand résidu hydrophobe W6.48 a été remplacé par un plus petit résidu Y6.48 et ne forme pas de contact direct avec les ligands correspondants.

a, Alignement de séquence du motif D/E3.32-W6.48-Y7.43 dans différents membres humains et murins de TAAR. Ces 3 résidus conservés sont surlignés en fond bleu clair. b, Effets des mutations de résidus clés pour le motif D/E3.32-W6.48-Y7.43 et C/S3.36 de mTAAR9, mTAAR4, 5 et 8c en réponse à la stimulation avec l'agoniste respectif (SPE, PEA, TMA et 1-MPD). La heatmap est colorée en fonction de la valeur de ΔpEC50 (ΔpEC50 = pEC50 du mutant - pEC50 de type sauvage). ND, signal non détectable. Les valeurs ont été moyennées à partir de 3 expériences indépendantes (n = 3). c, Courbes dose-réponse des mutations de résidus clés pour le motif D3.32-W6.48-Y7.43 et C/S3.36 de mTAAR9 (d), mTAAR8c (e), mTAAR5 (f) et mTAAR4 (g) en réponse à une stimulation avec des agonistes respectifs (SPE, 1-MPD, TMA et PEA). Les valeurs sont représentées sous forme de moyenne ± SEM de 3 expériences indépendantes (n = 3). Bien que le C/S3.36 conservé puisse former des interactions de liaison H avec la chaîne principale de D/E3.32, la mutation de C3.36 en A dans mTAAR9, mTAAR4, mTAAR5 et mTAAR8c n'a provoqué aucun effet significatif sur l'activation induite par l'odeur. de ces récepteurs, ce qui suggère que le rôle de la liaison H médiée par C/S3.36 avec la chaîne principale de D/E3.32 est indispensable dans l'activation ordinaire des récepteurs TAAR.

a, Courbes dose-réponse de la dissociation Gαs-Gβγ dans les récepteurs (mTAAR1-6, 7d, 8c et 9) surexprimant les cellules HEK293 en réponse à la stimulation par SPE. Les valeurs sont représentées sous forme de moyenne ± SEM de 3 expériences indépendantes (n = 3). b, La valeur RMSD moyenne de SPE (panneau supérieur) et des résidus de site de liaison dans le complexe SPE-mTAAR5 lors de simulations MD de 200 ns en triple. La structure simulée globale de MD a été illustrée à la Fig. 14b supplémentaire. Nous avons construit les coordonnées de mTAAR5 en utilisant notre structure mTAAR9 résolue comme modèle via SWISS-MODEL. c, représentation 3D des interactions détaillées entre SPE et les résidus D1143.32, Y2957.34 de mTAAR5. de, Courbes dose-réponse des mutations de résidus clés dans la poche de reconnaissance de polyamine de mTAAR9 (d) et mTAAR5 (e) en réponse à la stimulation par SPE. Les valeurs sont représentées sous forme de moyenne ± SEM de 3 expériences indépendantes (n = 3). f, représentation structurelle des effets potentiels de mutations structurellement équivalentes de mTAAR6, mTAAR7d et mTAAR8c. Les interactions conservées de dans la poche de reconnaissance des polyamines (T3.29 et T1133.33) ont été imitées en générant des mutations de V1133.33 en T dans mTAAR6, S1243.39 et G1283.33 en T dans mTAAR7d, et S1083.29 et V1123. 33 à T dans mTAAR8c. g, courbes dose-réponse des cellules HEK293 surexprimant mTAAR6, mTAAR7d, mTAAR8c et les mutants indiqués dans la poche de reconnaissance de la polyamine selon la figure 4f en réponse à la stimulation SPE. Les valeurs sont représentées sous forme de moyenne ± SEM de 3 expériences indépendantes (n = 3).

a, La puissance et l'efficacité de la dissociation Gαs-Gβγ dans les récepteurs (mTAAR2-6, 7d, 8c et 9) surexprimant les cellules HEK293 en réponse à la stimulation avec PEA. La carte thermique est colorée en fonction de la valeur de pEC50 et Emax de 3 expériences indépendantes (n = 3). ND, signal non détectable. b, Courbes dose-réponse de la dissociation Gαs-Gβγ dans les récepteurs (mTAAR2-6, 7d, 8c et 9) surexprimant les cellules HEK293 en réponse à la stimulation avec PEA. Les valeurs sont représentées sous forme de moyenne ± SEM de 3 expériences indépendantes (n = 3). c, Effets des mutations de résidus clés dans la poche hydrophobe de liaison SPE de mTAAR9 en réponse à la stimulation avec SPE. La heatmap est colorée en fonction de la valeur de ΔpEC50 (ΔpEC50 = pEC50 du mutant - pEC50 de type sauvage). Les valeurs provenaient de 3 expériences indépendantes (n = 3). d, Courbes dose-réponse des mutations des résidus clés dans la poche hydrophobe de liaison SPE de mTAAR9 en réponse à la stimulation avec SPE. Les valeurs sont représentées sous forme de moyenne ± SEM de 3 expériences indépendantes (n = 3). De manière cohérente, des mutations structurellement équivalentes de ces 4 résidus hydrophobes de F1173.37T, F1684.61V, Y2746.51C, V2977.39T/C et V3007.42A/G ont diminué l'activation de mTAAR9 induite par SPE. ef, Courbes dose-réponse des cellules HEK293 surexprimant le type sauvage et les mutants (F1684.61L et V3007.42A) de mTAAR9 (c) ou le type sauvage et les mutants (L170F4.61 et A2947.42V) de mTAAR5 (d) en réponse à SPE stimulation. Les valeurs sont représentées sous forme de moyenne ± SEM de 3 expériences indépendantes (n = 3). La mutation de F1684.61L et V3007.42A dans mTAAR9 a en effet diminué l'activation des récepteurs induite par SPE de 5,13 ± 0,66- et 27,2 ± 5,04 fois, respectivement (e), alors que la mutation de L1704.61F et A2947.42V dans mTAAR5 a augmenté SPE- stimulé l'activation des récepteurs de 5,43 ± 0,55 et 9,26 ± 0,68 fois, respectivement (f). Ces résultats suggèrent que la liaison de ces 2 résidus contribue à la différence de puissance de SPE qui agit entre les 2 membres mTAAR. g, Effets des mutations des résidus clés dans la poche de liaison au PEA de mTAAR9 en réponse à la stimulation avec le PEA. La heatmap est colorée en fonction de la valeur de ΔpEC50 (ΔpEC50 = pEC50 du mutant - pEC50 de type sauvage). Les valeurs provenaient de 3 expériences indépendantes (n = 3). h, Courbes dose-réponse des mutations des résidus clés dans la poche hydrophobe de liaison au PEA de mTAAR9 en réponse à la stimulation avec le PEA. Les valeurs sont représentées sous forme de moyenne ± SEM de 3 expériences indépendantes (n = 3). Notamment, la mutation des quatre résidus dans mTAAR4/6/7d/9 en résidus structurellement équivalents présents dans d'autres mTAAR, y compris F/Y3.37L/T, Y6.51C, Y7.35L ou V7.39T/C, a significativement diminué la Activités mTAAR9 induites par le PEA. i, Effets des mutations de résidus clés dans la poche de liaison au PEA de mTAAR7d en réponse à la stimulation avec le PEA. La heatmap est colorée en fonction de la valeur de ΔpEC50 (ΔpEC50 = pEC50 du mutant - pEC50 de type sauvage). Les valeurs provenaient de 3 expériences indépendantes (n = 3). j, Courbes dose-réponse des mutations des résidus clés de mTAAR7d en réponse à la stimulation avec PEA par test de dissociation Gαs-Gβγ. Les valeurs sont représentées sous forme de moyenne ± SEM de 3 expériences indépendantes (n = 3). Notamment, la mutation des quatre résidus dans mTAAR4/6/7d/9 en résidus structurellement équivalents présents dans d'autres mTAAR, y compris F/Y3.37L/T, Y6.51C, Y7.35L ou V7.39T/C, a significativement diminué la Activités mTAAR7d induites par le PEA.

a, Comparaison de la structure simulée d'apo-mTAAR9 (cyan) avec le modèle d'apo-mTAAR9 généré par AlphaFold2 (gris). b, La valeur RMSD moyenne de l'apo-mTAAR9 pendant trois fois 200 ns de simulation MD. c, Comparaison de la structure cryo-EM de SPE-mTAAR9 (bleu) avec le modèle simulé d'apo-mTAAR9 (gris). Alors que l'extrémité cytoplasmique de TM6 dans les structures liées à l'agoniste de mTAAR9 montre un déplacement vers l'extérieur significatif, l'extrémité extracellulaire de TM1 montre un mouvement vers l'intérieur. d, Comparaison structurelle de TM3 et TM6 dans β2AR inactif (cyan), complexe β2AR-Gs (vert clair, PDB : 3SN6), mTAAR9 inactif (gris), complexe mTAAR9-Gs (bleu clair). La comparaison des structures correspondantes dans le mTAAR9 et le β2AR montre que l'interaction directe de ces agonistes avec l'interrupteur à bascule W2716.48 a poussé son mouvement vers le bas, accompagné d'un déplacement vers le bas des F2676.44 et A2636.40 situés sur deux hélices adjacentes utilisant TM3 comme une référence. Et l'angle de séparation entre TM3 et TM6 dans mTAAR9 était plus grand que celui dans β2AR actif en raison de la substitution de I2786.40 par β2AR par A2636.40 dans mTAAR9 car cette substitution perturbe son interaction avec R1303.50 conservé. e, Alignement de séquence du membre TAAR et des membres sélectionnés de la famille GPCR de classe A sur les résidus clés de TM6 importants pour l'activation du récepteur. Les résidus conservés sont mis en évidence avec des polices rouges. Il est important de noter que W2716.48 et F2676.44 sont conservés dans toute la famille TAAR, sauf que les membres TAAR5 ont Y6.44, ce qui suggère que les changements de conformation dans les interrupteurs à bascule conservés W6.48 et F/Y6.44, ainsi que l'emballage les changements entre TM3 et TM6, sont des mécanismes communs potentiels qui interviennent dans l'activation des TAAR couplés au Gs/Golf. f, effets mutationnels de l'A6.40, y compris A2636.40I et A2636.40L sur l'activité mTAAR9-Golf ou mTAAR9-Gs induite par PEA, et A2576.40I et A2576.40L sur mTAAR5-Golf ou mTAAR5-Gs induit par TMA l'activité ont été évaluées via un test de dissociation Gαs-Gβγ. La heatmap est colorée en fonction de la valeur de ΔpEC50 (ΔpEC50 = pEC50 du mutant - pEC50 de type sauvage). Les valeurs provenaient de 3 expériences indépendantes (n = 3). gj, courbes dose-réponse des mutations de résidus pour A6.40, y compris A6.40I et A6.40L dans mTAAR9 (gh) ou mTAAR5 (ij) en réponse à la stimulation avec PEA ou TMA par test de dissociation Gαs/olf-Gβγ. Les valeurs sont représentées sous forme de moyenne ± SEM de 3 expériences indépendantes (n = 3).

a, Représentation détaillée de l'interface de liaison mTAAR9 avec Gs. L'interface est composée d'ICL2, des extrémités cytoplasmiques de TM3, TM5, TM6, de l'hélice 8 de mTAAR9 (aigue-marine moyenne) et de la boucle α4-β6, de l'hélice α5, de la boucle β2-β3 de Gs (rose). b, représentation 3D des interactions détaillées entre l'extrémité C-terminale de l'hélice α5 dans le Gαs et mTAAR9. Le Y391G.H5.23 et L388G.H5.20 forment des contacts étendus avec la surface hydrophobe créée par V1343.54, I2205.61, A2245.65 et Q2275.68 de mTAAR9. c, représentation 3D des interactions détaillées entre Y391G.H5.23, E392G.H5.24, extrémités carboxyoxylates C-terminales de l'hélice α5 de Gαs et R1303.50, K2556.32 de mTAAR9. Les distances des liaisons hydrogène sont représentées par des lignes pointillées rouges. Y391G.H5.23 s'engage dans π : interaction cationique avec R1303.50. Les extrémités E392G.H5.24 et carboxylate C-terminal de l'hélice α5 de Gαs ont formé des liaisons H ou des interactions charge-charge avec K2556.32 de mTAAR9. d, Structure globale de l'interface de liaison de l'ICL2 de mTAAR9 avec la boucle αN, β2-β3 et l'hélice α5 de Gs. e, représentation 3D des interactions détaillées entre Y140ICL2, P137ICL2, L138ICL2 de mTAAR9 et H41G.S1.02, V217G.S3.01, F376G.H5.08, C379G.H5.11, R380G.H5.11, I383G.H5 .15, Q384G.H5.16, H387G.H5.19, Y391G.H5.23 de Gaz. Les P137ICL2 et L138ICL2 sont situés dans un cratère hydrophobe créé par H41G.S1.02, V217G.S3.01, C379G.H5.11, F376G.H5.08, R380G.H5.12, I383G.H5.15 et Q384G. H5.16 de Gαs. Y140ICL2 est impliqué dans l'interaction π:π avec H387G.H5.19 et Y391G.H5.23. Les P137ICL2 et L138ICL2 sont situés dans un cratère hydrophobe créé par les brins β1-β3 et l'hélice α5 de Gαs. f, représentation 3D des interactions détaillées entre l'hélice α5 C-terminale de Gαs et le segment initial dans le H8 de mTAAR9. Les distances des liaisons hydrogène sont représentées par des lignes pointillées rouges. g, Comparé à V287G.S5.02 dans Gαs, I274G.S5.02 dans Gαolf a une association plus étroite avec I263G.H3.12, W264G.H3.13 et F260G.H3.0. Au niveau du segment initial dans le H8 de mTAAR9, Y3158.47 et W3178.49 constituent une paroi latérale qui accueille l'extrémité crochet de l'hélice α5 C-terminale de Gαs et forme une liaison hydrogène avec R1303.50 pour stabiliser la structure active de mTAAR9 . h, représentation structurelle 3D des différences entre l'interface mTAAR9-Golf (Golf en violet moyen) et l'interface mTAAR9-Gs (Gs en rose). La comparaison de K343G.h4s6.12/D341G.h4s6.10 dans Gαolf et R356G.h4s6.12/D354G.h4s6.10 dans Gαs. Les distances des liaisons hydrogène sont représentées par des lignes pointillées rouges. Les K343G.h4s6.12 et D341G.h4s6.10 dans Gαolf ont formé des interactions charge-charge plus faibles et sont plus séparés par rapport à la paire structurelle équivalente R356G.h4s6.12 et D354G.h4s6.10 dans Gαs. i, représentation 3D des interactions détaillées entre V134ICL2 et V2235.64 de mTAAR9 et L375G.H5.20 et Q371G.H5.16 de Gαolf et superposition de ces interactions avec celles entre V134ICL2 et V2235.64 de mTAAR9 et L388G.H5. 20 et Q371G.H5.16 de Gαs. Les changements conformationnels des extrémités cytoplasmiques de TMD ont permis une interaction plus étroite de V2235.64 et V1343.54 dans mTAAR9 avec Q371G.H5.16 et L375G.H5.20 dans Gαolf. mTAAR9 lié à Gs est représenté en aigue-marine moyen, mTAAR9 lié à Golf est représenté en rose vif, Gs est représenté en rose, Golf est représenté en violet moyen. j, représentation 3D des interactions détaillées entre R3198.51 de mTAAR9 et E379G.H5.24 de Gαolf ou E392G.H5.24 de Gαs. À l'extrémité C-terminale de l'hélice α5 de Gαolf, E379G.H5.24 forme des interactions charge-charge plus fortes avec R3198.51 de mTAAR9 par rapport à celles de Gαs. k, représentation 3D des interactions détaillées entre P141ICL2, F144ICL2 de mTAAR9 et K31G.hns1.02 de Gαolf comparées à celles entre P141ICL2, F144ICL2 de mTAAR9 et R38G.hns1.02 de Gαs (f). Les distances des liaisons hydrogène sont représentées par des lignes pointillées rouges. Bien que ICL2 de mTAAR9 forme des modèles d'interaction similaires avec Gαs et Gαolf, le remplacement de R38G.hns1.02 dans Gαs par K31G.hns1.02 dans Gαolf a supprimé l'interaction avec P141ICL2 et la chaîne principale F144ICL2 de mTAAR9.

Ce fichier contient des figures supplémentaires. 1–21 et tableaux supplémentaires 1–10.

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Réimpressions et autorisations

Guo, L., Cheng, J., Lian, S. et al. Base structurelle de la perception odorante des amines par un récepteur olfactif de mammifère. Nature 618, 193-200 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-06106-4

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Reçu : 14 octobre 2022

Accepté : 20 avril 2023

Publié: 24 mai 2023

Date d'émission : 01 juin 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41586-023-06106-4

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