Ne pas

Communications Biology volume 5, Article number: 803 (2022) Citer cet article

1757 accès

6 Citations

3 Altmétrique

Détails des métriques

Les attentes concernant la greffe de cellules souches/progénitrices neurales (NS/PC) en tant que traitement des lésions de la moelle épinière (SCI) augmentent. Cependant, si et comment les cellules greffées sont incorporées dans le circuit neuronal de l'hôte et contribuent à la récupération de la fonction motrice restent inconnues. L'objectif de ce projet était d'établir un nouveau système d'imagerie in vivo non invasif pour visualiser l'activité des greffons neuronaux par lequel nous pouvons simultanément démontrer l'intégration au niveau du circuit entre le greffon et l'hôte et la contribution de l'activité neuronale du greffon au comportement de l'hôte. . Nous avons introduit Akaluc, une luciférase nouvellement conçue, sous le contrôle d'un élément sensible à l'activité synaptique améliorée (E-SARE), un puissant promoteur synthétique dépendant de l'activité neuronale, dans les NS/PC et greffé les cellules dans des souris modèles SCI. Grâce à l'utilisation de ce système, nous avons constaté que l'activité des cellules greffées était intégrée au comportement de l'hôte et pilotée par les entrées du circuit neuronal de l'hôte. Ce système non invasif devrait aider à élucider le mécanisme thérapeutique du traitement par greffe de cellules pour SCI.

Les lésions de la moelle épinière (SCI) entraînent un dysfonctionnement neurologique grave, notamment des paralysies motrices, sensorielles et autonomes. Ces dernières années, de nombreuses tentatives de développement de thérapies de transplantation cellulaire pour favoriser la régénération de la moelle épinière endommagée ont été faites. Les cellules souches/progénitrices neurales (NS/PC) comptent parmi les ressources les plus prometteuses pour de telles thérapies1,2,3. Plusieurs mécanismes sous-jacents putatifs ont été suggérés, y compris le remplacement cellulaire par des neurones, des astrocytes et des oligodendrocytes greffés dérivés de NS/PC ; support trophique; et la remyélinisation axonale4,5,6. De plus, plusieurs études ont proposé que les greffes NS/PC puissent former des relais neuronaux à travers les sites de transection vertébrale7,8,9, c'est-à-dire combiner l'entrée de la partie rostrale de l'hôte vers la greffe et la sortie de la greffe vers la partie caudale ; on pense que ces processus jouent un rôle majeur dans la récupération fonctionnelle. Cependant, une caractérisation détaillée du relais neuronal n'a pas été réalisée et la manière dont le greffon s'intègre fonctionnellement dans le circuit neuronal de l'hôte est mal comprise. C'est principalement parce qu'aucune technologie actuelle ne peut surveiller directement les relations entre l'activité des cellules greffées et les comportements et les activités au niveau du circuit de l'hôte. Pour élucider la coordination fonctionnelle hôte-greffe et pour évaluer comment la greffe influence l'activité du circuit neuronal de l'hôte et le comportement de l'hôte, une nouvelle technique d'imagerie in vivo non invasive pour surveiller l'activité des neurones du greffon au fil du temps chez l'hôte vivant est nécessaire.

Pour réaliser un tel système de surveillance in vivo, nous nous sommes concentrés sur deux nouvelles technologies. Le premier était le système AkaBLI (une combinaison de l'enzyme AkaLuc et de l'AkaLumine-HCl comme substrat à haute perméabilité)10,11. L'imagerie par bioluminescence (BLI) est une méthode non invasive pour mesurer le rendement lumineux des cellules exprimant l'enzyme luciférase après l'administration de luciférine (substrat) chez des animaux vivants12. AkaBLI est un nouveau système BLI décalé vers le rouge qui produit des spectres d'émission lumineux et permet l'imagerie des tissus profonds chez les animaux vivants10, ce qui est le plus approprié pour la surveillance non invasive à champ large de l'expression génique des cellules greffées dans les moelles épinières blessées. Le second était l'élément sensible à l'activité synaptique amélioré (E-SARE), un puissant promoteur synthétique dépendant de l'activité neuronale13. Lorsqu'un neurone devient actif, il active les gènes précoces immédiats (IEG), tels que Fos, Arc et Egr1, même dans les neurones de la moelle épinière, et les promoteurs/amplificateurs des IEG sont utilisés comme systèmes rapporteurs dépendant de l'activité14,15. Parmi ces promoteurs se trouve le promoteur synthétique E-SARE, qui est basé sur l'élément activateur SARE du promoteur Arc et entraîne une expression génique dépendante de l'activité neuronale nettement supérieure à celle de tout autre promoteur IEG existant.

Dans cette étude, nous avons combiné les technologies AkaBLI et E-SARE et mis en place un nouveau système non invasif pour visualiser l'activité neuronale du greffon in vivo. Nous avons réussi à imager la dynamique d'ensemble actif de cellules dérivées de NS/PC greffées dans des moelles épinières lésées. En utilisant ce système, nous avons confirmé que l'activité du greffon est liée au comportement de l'hôte et que le circuit de l'hôte régule l'activité du greffon.

Pour établir un système basé sur la bioluminescence pour visualiser l'activité neuronale, nous avons d'abord construit un vecteur lentiviral pour l'expression d'AkaLuc, une luciférase optimisée pour la bioluminescence décalée vers le rouge, sous le contrôle de E-SARE, un puissant promoteur dépendant de l'activité neuronale généré à partir de l'activateur Arc éléments (Fig. 1a). Nous avons appelé ce système ESAL (E-SARE-AkaLuc). Dans le système ESAL, nous avons également fusionné AkaLuc avec la protéine Venus pour un marquage fluorescent simultané et avec la séquence PEST pour raccourcir la demi-vie de la protéine de fusion16. La protéine Venus est une mutation contenant la protéine fluorescente jaune (YFP) dérivée d'Aequorea victoria qui provoque une maturation rapide et une résistance environnementale accrue17. Nous avons ensuite transfecté le vecteur lentiviral ESAL dans des NS / PC dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l'homme (iPSC), identifiés comme ESAL-NS / PC, et avons induit la différenciation des cellules en neurones (Fig. 1b – h). Lorsqu'ils sont stimulés par une concentration dépolarisante de chlorure de potassium (50 mM), les neurones dérivés d'ESAL-NS / PC ont montré des augmentations significatives du nombre de photons AkaLuc par rapport à ceux des témoins non stimulés (Fig. 1b, c). Nous avons également détecté des augmentations de la fluorescence de Vénus et de l'expression de l'IEG lors d'une stimulation au KCl 50 mM (Fig. 1d, e). Ainsi, nous avons confirmé que le système ESAL était très sensible à la stimulation dépolarisante dans les neurones mais montrait peu de réponse dans les cellules non neuronales (Fig. 1f – h). Ces données suggèrent que le système ESAL peut être utilisé pour surveiller avec succès l'activité neuronale des neurones dérivés de NS/PC.

a Illustration schématique de la construction E-SARE-Venus-AkaLuc (ESAL), qui a été utilisée pour exprimer l'enzyme luminescente AkaLuc fusionnée avec Venus sous le contrôle du promoteur E-SARE. Lorsqu'un neurone était activé, le promoteur E-SARE entraînait une expression élevée du gène rapporteur en aval Venus-AkaLuc. b Imagerie comparative par bioluminescence (BLI) de cellules cultivées in vitro stimulées avec du KCl 50 mM pendant 6 h (à droite, n = 4) ou sans stimulation (à gauche, n = 4) à gauche. Nous avons préparé n = 8 puits à partir de deux neurosphères tertiaires indépendantes du même corps embryoïde (EB). La couleur des barres indique le rayonnement total de la bioluminescence (photons/sec/cm2/str). Le stéradian (str) est l'unité de l'angle solide. c Analyses quantitatives de l'intensité relative du signal BLI des cellules dérivées d'ESAL-NS/PC avec ou sans addition de 50 mM de KCl in vitro (n = 4 chacune). Les valeurs sont la moyenne ± erreur standard de la moyenne (SEM) : **p < 0,01. Un test t de Student bilatéral non apparié a été réalisé. Valeur T et degrés de liberté : t (6) = 11,59, p = 2,5 × 10−5. d Image microscopique en fond clair et image de fluorescence de Vénus de cellules dérivées d'ESAL-NS/PC avec ou sans ajout de 50 mM de KCl in vitro. Barre d'échelle, 50 μm. e Les résultats des analyses qPCR de l'expression génique de Venus, ARC et FOS dans les cellules du même puits, comme indiqué ci-dessus (n = 4 chacun). Les valeurs sont la moyenne ± SEM : *p < 0,05, **p < 0,01. Un test t de Student bilatéral non apparié a été réalisé. Valeurs t individuelles et degrés de liberté : Vénus t(6) = 3,034, p = 0,023. Arc t(6) = 2,705, p = 0,035. Fos t(6) = 7,057, p = 4,1 × 10−4. f, g Images représentatives de cellules différenciées exprimant Vénus de NS/PC colorées pour une vision anormale létale panembryonnaire (pan-ELAVL) (neurones) avec ou sans l'ajout de 50 mM de KCl (f) ; coloré pour la protéine acide fibrillaire gliale humaine (GFAP) (astrocytes), la 2ʹ, 3ʹ-nucléotide 3ʹ-phosphodiestérase (CNPase) (oligodendrocytes), Nestin et Ki-67 (cellules immatures) avec l'ajout de 50 mM de KCl (g). Barre d'échelle, 20 μm. h Pourcentage de cellules positives pour les marqueurs spécifiques au type cellulaire parmi les cellules Venus+ après stimulation avec 50 mM de KCl.

Pour profiler la résolution temporelle du système ESAL, nous avons examiné l'évolution temporelle de la bioluminescence après un bref épisode de stimulation neuronale (4-Amynopyridine [4AP] + bicuculline [BIC]) qui facilite le déclenchement du potentiel d'action et potentialise la transmission glutamatergique (Fig. 1a). La bioluminescence dépendante de l'activité neuronale a été détectée environ 4 h après la stimulation, a atteint son apogée à 6 h et est revenue au niveau basal à 24 h (Fig. 1b supplémentaire). Ces résultats indiquent qu'une augmentation de la bioluminescence dans le système ESAL reflète l'activité neuronale cumulative qui a persisté pendant une période allant de 4 à 10 h avant la mesure BLI mesurée.

Ensuite, des souris NOD/ShiJic-scidJcl (NOD-SCID) ont été soumises à une transection de la colonne dorsale C5 au niveau de la colonne vertébrale et à une transplantation 9 jours après la blessure. Nous avons considéré que l'environnement hôte était le plus approprié pour la transplantation à ce moment parce que l'inflammation aiguë après la SCI s'est calmée, tandis que la formation de la cicatrice gliale n'est pas encore terminée18,19,20,21. Les ESAL-NS / PC ont été transplantés dans les sites de blessure (Fig. 2a, f). Nous avons constaté que la force de préhension normalisée par le poids corporel et le score IBB s'étaient améliorés de manière significative dans le groupe TP que dans le groupe PBS (Fig. 2a, b supplémentaires). Cependant, aucun changement significatif lié à la récupération n'a été trouvé dans le taux d'erreur pour le test de l'échelle horizontale (Fig. 2c supplémentaire).

a Illustration schématique des souris témoins positives. La transplantation de NS/PC doublement infectés par les deux virus (CAG-hM3Dq-mCherry, qui contient une protéine de fusion hM3Dq et mCherry, et ESAL ont été transduits en NS/PC via un lentivirus) a été réalisée 9 jours après la transection de la colonne dorsale C5. Six semaines après la transplantation, des mesures de luminescence ont été effectuées avant le sacrifice. b Comparaison des rapports d'intensité du signal BLI (7 h post-CNO/pré-CNO) entre les souris NS/PC-transplantées exprimant ESAL (ESAL-NS/PC-transplantées) (hM3Dq [−] TP, n = 4) et des souris transplantées NS/PC doublement infectées (hM3Dq [+] TP, n = 3) sont présentées. Les valeurs sont la moyenne ± SEM : *p < 0,05. Un test t de Student bilatéral non apparié a été réalisé. Valeur T et degrés de liberté : t(5) = 3,977, p = 0,011. c Images IVIS représentatives d'une souris témoin positive (pré- et post-CNO). Le cercle montre la région d'intérêt (ROI) dans la colonne cervicale. La couleur des barres indique le rayonnement total de la bioluminescence (photons/sec/cm2/str). d, e Images représentatives d'une souris témoin positive 6 semaines après la transplantation ; étiquetés avec Vénus (vert), mCherry (rouge) et HNA (cellules humaines) (bleu) (d) ou étiquetés avec Vénus (vert), Fos (rouge) et HNA (bleu) (e). Barres d'échelle, 20 μm. f Illustration schématique d'expériences in vivo. La transplantation des ESAL-NS/PC a été effectuée 9 jours après la section transversale de la colonne dorsale C5. Trois, 6 et 9 semaines après la transplantation, des mesures de luminescence ont été effectuées. Toutes les souris ont été sacrifiées 10 semaines après la transplantation. g Images représentatives de cellules greffées d'une souris transplantée ESAL-NS/PC étiquetées avec Vénus (vert), pan-ELAVL (rouge ; pointes de flèches) et HNA (bleu). Barres d'échelle, 20 μm. h Changement dépendant du temps de l'intensité de la luminescence du greffon des souris transplantées ESAL-NS/PC à 3, 6 et 9 semaines après la transplantation (n = 12 souris). Les valeurs sont la moyenne ± SEM : *p < 0,05. NS : non significatif. Une ANOVA à mesures répétées a été réalisée. Valeurs p individuelles : semaines 3 et 6 ; 0,1735, semaines 6 et 9 ; 0,2007, semaines 3 et 9 ; 0,0035. i Images représentatives de cellules greffées provenant de tissus de souris transplantés ESAL-NS/PC marqués avec Vénus (vert), APC (oligodendrocytes), GFAP (astrocytes), Ki-67/Nestin (rouge ; pointes de flèches) et HNA (bleu). Barres d'échelle, 20 μm.

Pour manipuler artificiellement l'activité neuronale dans les cellules greffées, nous avons introduit hM3Dq, un récepteur chimiogénétique stimulant et un récepteur designer exclusivement activés par des drogues de synthèse (DREADD), qui permettaient d'activer la greffe lors de l'administration de son ligand22,23 dans ESAL-NS/ PC (Fig. 2a). Lorsque les greffons ont été activés par l'administration du N-oxyde de clozapine (CNO) du ligand hM3Dq, la bioluminescence a été significativement régulée à la hausse (Fig. 2b, c). De manière constante, dans les analyses immunohistochimiques, l'expression de la protéine Venus a été détectée exclusivement dans les cellules exprimant hM3Dq, tandis que les cellules greffées mCherry + exprimaient principalement la protéine Venus lors de l'activation de CNO (Fig. 2d). Pour confirmer que cela s'est produit parce que l'efficacité de transfection lentivirale était très élevée, nous avons calculé l'efficacité de transfection de ESAL et DREADD dans les NS/PC via un vecteur lentiviral in vivo. Premièrement, l'efficacité de transfection de hM3Dq sous un promoteur ubiquitaire, c'est-à-dire la population de cellules mCherry + à partir de cellules d'antigène neutrophile humain (HNA) +, était de 90, 0 ± 1, 1% (Fig. 2d, Fig. 2d supplémentaire) (de n = 3 animaux). Deuxièmement, l'efficacité d'expression d'ESAL a été approchée en fonction de la population de cellules doublement positives Venus + mCherry + parmi les cellules mCherry + sous activation CNO omniprésente. Le pourcentage Venus + mCherry + / mCherry + a été déterminé à 83, 9 ± 2, 5% (Fig. 2d, Fig. Supplémentaire 2d) (à partir de n = 3 animaux). Dans l'ensemble, les efficacités de transfection ont été considérées comme suffisamment élevées pour interpréter les résultats de la bioluminescence. Conformément à cela, les cellules Venus + étaient souvent immunopositives pour Fos, un marqueur et un IEG (68,9 ± 3,0%) (Fig. 2e), même si la protéine Fos est immédiatement régulée positivement par l'activité neuronale et est un facteur de transcription de courte durée24,25 . Ces données suggèrent que le système ESAL a étiqueté avec succès des ensembles actifs dans les neurones greffés dans les souris modèles SCI.

Le pourcentage de cellules neuronales positives pour ELAVL (Hu) humaines était très élevé parmi les cellules positives pour Vénus (76, 2 ± 8, 6%) (Fig. 2e supplémentaire). Même sans activation artificielle par hM3Dq, nous avons trouvé l'expression de Vénus dans une partie des greffes neuronales (Fig. 2f, g). Cette découverte suggère que le système ESAL peut signaler des neurones présentant une activité spontanée dans le greffon. Ceci est conforme à l'évolution temporelle de l'élévation de la bioluminescence ESAL mesurée chronologiquement après la transplantation ESAL-NS / PC, suggérant qu'une progression de la différenciation neuronale et de la maturation des NS / PC précède une augmentation significative de la détection de la bioluminescence (Fig. 2h). Conformément à cette idée, nous avons confirmé que peu de cellules gliales présentaient l'expression de Vénus (GFAP + / Venus +, 4, 0 ± 1, 5%; APC + / Venus +, 3, 3 ± 2, 5%) (Fig. 2i).

Des rapports antérieurs ont suggéré qu'après une lésion du tractus neuronal de l'hôte, les neurones greffés s'intègrent et font partie des circuits au sein du tract9,26. À l'aide du système ESAL, nous avons examiné l'effet de l'activité de l'hôte sur l'activité du greffon neuronal au niveau de l'individu et du circuit. Tout d'abord, nous avons surveillé la bioluminescence ESAL au cours de la journée et avons constaté que la bioluminescence ESAL était la plus élevée vers midi et la plus faible la nuit (Fig. 3 supplémentaire). Étant donné que la bioluminescence ESAL reflète l'activité neuronale cumulative environ 6 h avant l'observation (Fig. 1 a, b supplémentaire), ce résultat indique que l'activité neuronale du greffon présente des variations diurnes compatibles avec l'activité maximale et minimale des animaux hôtes pendant les périodes de nuit et de jour. , respectivement. Pour déterminer davantage dans quelle mesure l'activité de l'hôte influence l'activité du greffon au niveau individuel, nous avons ensuite utilisé une anesthésie à long terme (avec une combinaison de midazolam, de chlorhydrate de médétomidine et de butorphanol) pour imiter le sommeil (Fig. 3a). Le rythme respiratoire des souris suggérait que l'anesthésie était active pendant au moins 6 h après l'administration. Pour augmenter le temps d'anesthésie à 9 h, nous avons en outre administré de l'isoflurane pendant les 3 h restantes. La bioluminescence ESAL a diminué à près de la moitié du niveau initial après une anesthésie à long terme (Fig. 3b, c). Cette diminution était significative à la fois 6 et 9 semaines après la transplantation (Fig. 3c). De plus, nous avons cherché à confirmer que le mélange de trois types d'agents anesthésiques ne pouvait pas modifier directement l'activité des neurones greffés à l'aide de neurones cultivés in vitro. En effet, l'intensité du signal BLI n'a pas été notablement réduite par les agents anesthésiques (Fig. 3d, e). Prises ensemble, ces données impliquent que l'activité neuronale du greffon est associée aux activités quotidiennes des hôtes au niveau individuel.

a Illustration schématique d'une anesthésie continue à long terme. L'anesthésie a été réalisée avec un mélange de trois types d'agents anesthésiques (butorphanol, chlorhydrate de médétomidine et midazolam) suivi d'une anesthésie par inhalation jusqu'à 9 h. b Images IVIS représentatives d'une souris transplantée ESAL-NS/PC avant et après une anesthésie continue à long terme 10 semaines après la transplantation. Le cercle montre la région d'intérêt (ROI) dans la colonne cervicale. La couleur des barres indique le rayonnement total de bioluminescence (photons/sec/cm2/sr). c Le rapport de l'intensité du signal BLI (pré- et 9 h post-anesthésie continue) à 6 et 9 semaines après la transplantation (n = 5 souris). Les valeurs sont la moyenne ± SEM : *p, #p < 0,05. Des tests t de Student appariés bilatéraux ont été effectués. Valeurs t individuelles et degrés de liberté : semaines 6 et 9 ; t(8) = 2,754, p = 0,025, semaine 6 ; t(8) = 2,502, p = 0,037, semaine 9 ; t(8) = 4,456, p = 2,1 × 10−3. d BLI comparatif de cellules cultivées in vitro avec (n = 4) ou sans (n ​​= 4) l'ajout des agents anesthésiques mixtes à deux concentrations différentes, 12/3/10 μM ("Basse concentration") et 30/7,5 /25 μM ("Haute concentration"), pendant 6 h (n = 4, 4 chacun). Nous avons préparé n = 8 puits à partir de deux neurosphères tertiaires indépendantes du même EB. La couleur des barres indique le rayonnement total de la bioluminescence (photons/sec/cm2/str). e Analyses quantitatives de l'intensité relative du signal BLI des cellules dérivées d'ESAL-NS/PC avec ou sans l'ajout des agents anesthésiques mixtes in vitro (n = 4, 4 chacun). Les valeurs sont la moyenne ± SEM : NS : non significatif. Des tests t de Student non appariés bilatéraux ont été effectués. Valeurs t individuelles et degrés de liberté : gauche : t(6) = 0,342, p = 0,744, droite : t(6) = 1,821, p = 0,118.

Nous avons ensuite étudié si et dans quelle mesure l'activité au niveau du circuit de l'hôte régule directement l'activité neuronale du greffon. Nous nous sommes concentrés sur le tractus corticospinal (CST), l'un des principaux circuits descendants qui joue un rôle central dans le contrôle sensorimoteur, et avons manipulé artificiellement l'activité CST en injectant dans le cortex moteur un virus adéno-associé (AAV) codant hM3Dq-mCherry sous le nom de hM3Dq-mCherry. contrôle du promoteur de la synapsine I humaine (Fig. 4a). Trois à quatre semaines après l'injection d'AAV27, nous avons confirmé que hM3Dq-mCherry permettait un marquage antérograde efficace sur le site de la lésion C5 via le CST (Fig. 4b). Ce marquage sélectif des projections CST sur le site de la lésion suggérait que les fibres CST innervaient le greffon (Fig. 4c, Fig. 5 supplémentaire). En effet, nous avons constaté que des synapses hôte-greffe s'étaient formées (Fig. 4d – g, Supplémentaire Fig. 6a – c), ce qui indique un contrôle de la greffe par CST. Pour tester cela directement, le CST a été activé par l'administration du ligand hM3Dq CNO, et nous avons détecté une augmentation induite par l'activité de l'expression de Venus fusionnée avec AkaLuc dans les cellules greffées par des analyses immunohistochimiques (Fig. 4h – j). De plus, l'augmentation de l'activité du greffon induite par la stimulation artificielle du CST lors du traitement par CNO a également été confirmée in vivo par des mesures BLI grâce à une augmentation du nombre de photons ESAL du greffon (Fig. 4h, k, l). Ces résultats suggèrent que les entrées CST de l'hôte innervent et régulent l'activité du greffon.

a Illustration schématique représentant le calendrier des expériences in vivo. Six semaines après la transplantation d'ESAL-NS/PC, les souris ont été soumises à une injection d'AAV dans le cortex moteur. Dix semaines après la transplantation, des mesures de luminescence ont été effectuées avant le sacrifice. b Confirmation des corps cellulaires marqués mCherry dans le cortex cérébral (barres d'échelle, 250 μm) et des axones marqués mCherry dans la moelle épinière (barres d'échelle, 500 μm) et la moelle épinière cervicale au niveau 1/2 (barres d'échelle, 100 μm ). Des extrémités d'axones mCherry + CST ont été observées dans la substance grise rostrale de la zone lésionnelle C5 (barres d'échelle, 250 μm), et peu d'axones CST ont été observés caudale à la lésion (barres d'échelle, 250 μm). R : droite, L : gauche, D : dorsale et V : face ventrale. c Images sagittales représentatives à 400 μm du plan sagittal médian autour de la moelle épinière lésée. Les cellules transplantées ont été colorées avec STEM121 (un marqueur cytoplasmique spécifique à l'homme) et le CST a été marqué avec mCherry. Ligne pointillée, limite rostrale du greffon, R : rostral, C : caudal, D : dorsal et V : face ventrale. Barres d'échelle, 5 μm. d Vue à fort grossissement de la formation de synapses entre les axones CST et les neurones greffés. Le marqueur présynaptique synaptophysine a fusionné avec mCherry et était adjacent à une cellule STEM121+. Barres d'échelle, 2 μm. e Vue à fort grossissement de la formation de synapses entre les axones CST et les neurones greffés. Le marqueur post-synaptique pAMPAR a fusionné avec STEM121 et était adjacent à une cellule mCherry+. Barres d'échelle, 2 μm. f Graphique à barres montrant la quantification des synapses synaptophysine+ fusionnées avec mCherry intégré dans la zone STEM121+ dans chaque groupe transplanté (groupe d'activation CST, 20 images/n = 4 ; groupe de non-activation CST, 20 images/n = 4). Les valeurs sont la moyenne ± SEM : *p < 0,05. Un test t de Student bilatéral non apparié a été réalisé. Valeur T et degrés de liberté : t(38) = 0,128, p = 0,90. g Double image au microscope immunoélectronique de la connexion synaptique entre un neurone mCherry+ CST avec coloration au tétrahydrochlorure de 3,3'-diaminobenzidine (DAB) et un neurone greffé Venus+ avec coloration Immunogold. Le marquage anti-mCherry était localisé au niveau de la membrane du neurone CST et les protéines de Vénus étaient détectables sous forme de points noirs, principalement dans la membrane cytoplasmique. Pointes de flèches, densité post-synaptique. Barre d'échelle, 500 nm. h Illustration schématique démontrant que l'hôte CST entre dans les greffes de cellules souches neurales dans les sites de lésion de la moelle épinière C5. Lorsque les neurones CST sont activés via hM3Dq, les neurones greffés interconnectés avec des axones CST régénérés sont capables d'obtenir le promoteur E-SARE, entraînant une expression élevée du gène rapporteur en aval Venus-AkaLuc. R : rostral, C : caudal, D : dorsal et V : face ventrale. i Images représentatives de la moelle épinière cervicale axiale de la coloration de Vénus et HNA dans les tissus de souris avec ou sans activation CST. Les sections présentées ont été dérivées dans le même ordre à partir de l'axe rostro-caudal. Barres d'échelle, 1000 μm. Vénus est une protéine cytoplasmique, tandis que HNA est un antigène anti-nucléaire. j Comparaison du volume Vénus+/volume HNA+ calculé entre les groupes transplantés (groupe d'activation CST, n = 4 ; groupe de non-activation CST, n = 4). Un anticorps anti-GFP a été utilisé pour marquer la protéine Venus. Les valeurs sont la moyenne ± SEM : *p < 0,05. Un test t de Student bilatéral non apparié a été réalisé. Valeur T et degrés de liberté : t(6) = 2,573, p = 0,042. k Images IVIS représentatives d'une souris transplantée ESAL-NS/PC avant et après l'activation du CST (le même individu illustré à la Fig. 4i [à droite]). Le cercle montre la région d'intérêt (ROI) dans la colonne cervicale. La couleur des barres indique le rayonnement total de la bioluminescence (photons/sec/cm2/str). l Comparaison de l'intensité du signal BLI pour les souris transplantées ESAL-NS/PC avec ou sans activation CST pour chaque souris 10 semaines après la transplantation (n = 10 souris). Les valeurs sont la moyenne ± SEM : **p < 0,01. Le test t de Student bilatéral apparié a été réalisé. Valeur T et degrés de liberté : t(18) = 2,963, p = 8,3 × 10−3.

Combien de temps après la transplantation les apports CST augmentent-ils pour innerver les neurones greffés ? Pour répondre à cette question, la bioluminescence des greffons innervés par les neurones du CST a été mesurée longitudinalement. Fait intéressant, le rapport signal sur bruit (activation post-/pré-CST) a augmenté de manière significative des semaines 3 à 9 et des semaines 6 à 9, ce qui suggère que les entrées CST de l'hôte innervent et régulent l'activité du greffon, en particulier après la semaine 6 (Fig. .4a).

Comment se déroule l'évolution temporelle de l'activité ESAL après l'administration du CNO ? Un effet initial de l'administration systémique de CNO sur l'activité neuronale commence après 5 à 10 min et atteint son apogée 45 à 50 min après l'administration de CNO28,29,30. Considérant que le décalage temporel révélé par cette étude in vitro était de 6 h entre la conduite du promoteur ESARE et le pic d'expression de la protéine rapporteur d'ESAL, toutes les mesures ci-dessus ont été effectuées 7 h après l'administration de CNO (Fig. 4b supplémentaire). Pour la validation, nous avons effectué des mesures de comptage de photons ESAL à 4, 7 et 10 h après l'administration de CNO, en suivant le même animal individuel à des jours différents. Conformément aux résultats de l'étude in vitro, le rapport du nombre moyen de photons par état initial était le plus élevé à 7 h parmi les trois points dans le temps (4, 7 et 10 h), bien que la différence entre les rapports de nombre de photons à 4 h et 7 h par état initial n'étaient pas significatifs (Fig. 4c supplémentaire).

Ici, nous avons développé un nouveau système de bioimagerie, ESAL, en combinant une bioluminescence décalée vers le rouge sensible et précise, AkaBLI, et le promoteur dépendant de l'activité neuronale E-SARE. Ce système ESAL marque efficacement les neurones actifs dans les greffes neurales de la moelle épinière lésée. En utilisant ce système d'imagerie ESAL non invasif, nous avons démontré l'association directe entre l'activité du greffon et l'activité au niveau du circuit/comportement de l'hôte.

Les résultats de cette étude démontrent que le système ESAL est une méthode non invasive pour l'imagerie in vivo de l'activité du greffon dans la moelle épinière lésée. Le système ESAL peut imager l'activité neuronale spontanée et révéler l'interaction entre les circuits neuronaux du greffon et de l'hôte. Bien que certains groupes aient signalé une connectivité hôte-greffe dans des modèles SCI utilisant des techniques d'imagerie électrophysiologique31 ou calcique9, leurs expériences n'ont pas été réalisées chez les animaux SCI vivants. En revanche, le système ESAL peut être utilisé de manière entièrement non invasive, et nous avons montré in vivo que l'activité de l'hôte au niveau individuel, comme le sommeil et l'anesthésie à long terme, influence directement l'activité du greffon.

Le relais neuronal est un mécanisme central par lequel la transplantation NS/PC peut être utilisée pour traiter les SCI9,31,32. Des circuits de relais peuvent être établis entre les axones descendants de l'hôte et les neurones nouvellement différenciés des NS/PC transplantés. Cependant, le manque de méthodes de mesure in vivo non invasives a empêché l'élucidation de la façon dont les greffes neurales s'intègrent fonctionnellement dans les circuits de l'hôte et comment l'activité de la greffe contribue à la récupération comportementale. Notre système ESAL peut surveiller l'activité du greffon dans le contexte de divers comportements de l'hôte, conduisant à l'élucidation du mécanisme de formation du relais neuronal et de sa contribution à la récupération fonctionnelle.

L'intensité de la bioluminescence des cellules dérivées de NS/PC a augmenté de façon continue jusqu'à 9 semaines après la transplantation, ce qui suggère que l'activité de greffe spontanée a augmenté de façon concomitante. Ceci est en accord avec une étude précédente de notre groupe suggérant que plus de 6 semaines sont nécessaires pour la maturation neuronale des greffons33. Plusieurs rapports utilisant des organoïdes cérébraux dérivés d'iPSC humains ont également indiqué que la formation de synapses et l'activité spontanée commencent entre 4 et 6 semaines34. Sur la base des découvertes d'autres personnes et des nôtres, les résultats du système ESAL pourraient refléter la maturation neuronale et la formation de synapses in vivo.

Le débat demeure quant aux sous-types de NS/PC avec différentes identités régionales qui sont les plus appropriés pour la thérapie cellulaire31,35,36. Le système ESAL permettra de déterminer la qualité et l'adéquation des différents sous-types NS/PC intégrés dans l'hôte. La manière dont les greffes contribuent à la régénération tissulaire et à la restauration de la fonction motrice est restée insaisissable. Des rapports antérieurs ont montré qu'un prétraitement avec un inhibiteur de la γ-sécrétase (GSI) favorise la maturation des neurones dérivés de NS/PC en inhibant la signalisation Notch ;21 de plus, les antagonistes des récepteurs Nogo facilitent la régénération du tractus raphespinal37, et certains organisateurs de synapses ont été suggérés pour accélérer formation de synapses38. Ce système sera également utile pour évaluer les effets de ces composants moléculaires sur les greffes NS/PC et les circuits hôtes autour de la moelle épinière blessée.

Ainsi, ce système ESAL a le potentiel de révéler la contribution d'entrée synaptique de chaque voie descendante pour greffer des neurones dans la récupération de la fonction motrice. Les fonctions du CST comprennent le contrôle des entrées afférentes, des réflexes spinaux et de l'activité des motoneurones39. De plus, le CST est généralement reconnu comme la principale voie motrice des mouvements volontaires chez l'homme40. Chez les rongeurs, le CST ne commande que la capacité de préhension impliquant les fléchisseurs numériques, qui dépend largement du CST dorsal et dorsolatéral, ainsi que de l'échelle horizontale ou des tâches d'atteinte qualifiées41,42. Selon des études antérieures, le tractus rubrospinal ou réticulospinal pourrait être plus important que le CST pour la fonction motrice chez les rongeurs43,44. Il serait intéressant de vérifier le site de transplantation en utilisant ce système pour renforcer l'effet de la thérapie cellulaire.

En conclusion, cette étude introduit un nouveau système in vivo pour surveiller les neurones dérivés de cellules greffées et fournit des informations importantes sur l'importance du lien entre l'activité du greffon et le circuit et le comportement neuronaux de l'hôte. Nous avons démontré in vivo que la connectivité synaptique hôte-greffe était fonctionnellement établie après la transplantation NS/PC pour SCI. Une façon d'améliorer la thérapie cellulaire serait d'améliorer encore cette connectivité. La promotion de la maturation neuronale ou de la formation de synapses pourrait rendre la thérapie cellulaire avec ce système plus efficace à l'avenir.

L'activation du CST/greffon et l'enregistrement de l'activité du greffon dépendaient de l'expression virale de hM3Dq et ESAL. Les écarts dans l'efficacité de la transfection/expression pourraient affecter les analyses de l'intégration des cellules greffées dans le CST hôte. Une faible efficacité de transfection pourrait également rendre difficile l'interprétation des résultats concernant l'activité ESAL. Bien que le CST soit le principal composant contribuant au contrôle moteur, nous reconnaissons qu'une stimulation CST ponctuelle n'est pas suffisante pour améliorer le comportement des souris étant donné que la plasticité neuronale n'est pas censée être altérée. Au lieu de cela, une stimulation hM3Dq consécutive du CST peut permettre une amélioration simultanée des activités de circuit/comportement améliorant l'activité synaptique45,46. De plus, l'inactivation de la fonction CST par les CST-DREADD aiderait mieux à fournir des preuves de la connectivité hôte-greffe47.

Il est important de noter que ce système ne fournit pas d'évaluation en temps réel de l'activité neuronale en cours, mais a plutôt besoin d'une activité accrue sur plusieurs heures pour montrer un effet, reflétant l'activité neuronale cumulative. Une solution pour améliorer la résolution temporelle consiste à utiliser un indicateur d'activité neuronale en temps réel, tel que la concentration de calcium intracellulaire. En effet, un système luciférase dépendant du calcium, Orange CaMBI, a été rapporté48. Cependant, ce système est basé sur NanoLuc-furimazine et pourrait ne pas être approprié pour les greffes neurales en raison de sa faible perméabilité du substrat à travers la barrière hémato-encéphalique49,50. Une autre solution possible est l'utilisation d'un autre promoteur dépendant de l'activité, tel que le promoteur Fos51, qui est un promoteur dépendant de l'activité couramment utilisé et régulé à un niveau très bas en raison de l'autorépression de la transcription Fos par la protéine Fos52,53. Ainsi, pour amplifier l'expression dépendante du promoteur Fos, un système inductible tet est généralement ajouté en raison de l'activation transcriptionnelle par la tétracycline10. Cependant, ce système à double rapporteur Fos-tet nécessite un temps substantiel pour l'expression des gènes. En revanche, le système ESAL entraîne l'expression du rapporteur à un niveau suffisamment élevé pour être utilisé seul pour la surveillance des greffes, réalisant l'expression des gènes sur une période relativement courte.

Bien que nous nous soyons principalement concentrés sur la connexion hôte-greffon entre les neurones descendants de l'hôte et le greffon, d'autres études sont nécessaires pour évaluer l'interaction greffon-hôte entre le greffon et les neurones spinaux hôtes, tels que les motoneurones. Le système ESAL est disponible non seulement pour les greffes mais aussi pour les neurones hôtes grâce à l'utilisation d'AAV, car ESAL peut être conditionné dans un seul AAV en raison de sa petite taille. Par exemple, il serait possible de détecter l'activité des motoneurones spinaux en transfectant un vecteur viral rétrograde AAV dans la jonction neuromusculaire54. Des études futures permettront d'étendre notre compréhension de l'interaction mutuelle entre l'hôte et le greffon.

Pour construire un vecteur lentiviral pour ESAL, le promoteur E-SARE (tel que décrit dans la réf. 10, et disponible sur demande auprès de H. Bito au Département de neurochimie, Université de Tokyo Graduate School of Medicine) et Venus-AkaLuc-PEST cDNA (obtenus à partir d'un plasmide que nous avons reçu avec un MTA du RIKEN BRC) ont été clonés dans le vecteur lentiviral CSII. Pour construire un vecteur lentiviral pour l'activation omniprésente de DREADD, l'ADNc de hM3Dq-mCherry a été amplifié par réaction en chaîne par polymérase (PCR) à partir de pAAV-hSyn-hM3D(Gq)-mCherry (plasmide Addgene #50474) et transféré au vecteur lentiviral CSIV avec le CAG promoteur, qui est une construction hybride constituée de l'activateur du cytomégalovirus (CMV) fusionné avec le promoteur de la bêta-actine de poulet55.

Des vecteurs lentiviraux recombinants ont été produits par transfection transitoire de trois plasmides dans des cellules HEK 293T : pCAG-HIVgp, pCMV-VSV-G-RSV-Rev et le vecteur lentiviral CSII-E-SARE-Venus-AkaLuc-PEST ou CSIV-CAG- hM3Dq-mCherry56,57,58.

Le Centre de recherche et d'application sur les cellules iPS (CiRA) nous a fourni des cellules pluripotentes induites humaines (iPSC) générées et maintenues dans des conditions de bonnes pratiques de fabrication (BPF). Les NS/PC ont été générés à partir de la lignée iPSC humaine 414C259 par des méthodes décrites précédemment21,33,60. En bref, des iPSC humaines 414C2 ont été cultivées pendant 12 jours en culture d'adhésion avec des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF). Ensuite, des corps embryoïdes (EB) ont été générés à partir d'iPSC cultivés en suspension pendant 30 jours. Les EB ont ensuite été dissociés en cellules individuelles à l'aide de TrypLE Select (Thermo Fisher Scientific, MA, USA) et différenciés en suspension à une densité de 1,0 × 105 cellules / ml dans du milieu de cellules souches neurales KBM (Kohjin Bio, Saitama, Japon) complété avec B-27 (Thermo Fisher Scientific), 20 ng/ml de FGF-2 (PeproTech, NJ, USA) et 10 ng/ml de facteur inhibiteur de la leucémie humaine (hLIF ; Merck KGaA, Hesse, Allemagne) pendant 12 jours. Le FGF-2 a été ajouté tous les 3 jours et tous les milieux de culture cellulaire ont été changés tous les 6 jours. Ces neurosphères primaires ont été passées tous les 10 à 14 jours en les dissociant de la même manière que celle décrite ci-dessus. Après le premier passage, une infection lentivirale a été réalisée en culture pendant 3 jours, et des neurosphères tertiaires ont été utilisées pour les expériences suivantes. Compte tenu de l'efficacité de transfection calculée, nous avons ajusté les valeurs de MOI (multiplicité d'infection) pour les NS/PC à 6,7 (ESAL) et 2,7 (hM3Dq) en fonction du titre lentiviral par PCR quantitative (qPCR) et du nombre total de cellules par flacon, ce qui était constante tout au long des expériences. La détermination du titre a été effectuée par un test de titre lentiviral basé sur la qPCR conformément aux instructions du fabricant (Takara Bio, Shiga, Japon).

Des cellules nourricières d'astrocytes de souris, qui avaient été extraites du cortex cérébral de souris E17, ont été étalées sur des lames de verre à chambre à 24 puits recouvertes de poly-D-lysine (Sigma – Aldrich). Les cellules nourricières ont été cultivées à 37 °C dans 5 % de CO2 et 95 % d'air pendant 3 à 7 jours (5 × 104 cellules/puits). Les neurosphères quaternaires dissociées à l'aide de TrypLE Select ont été étalées sur des lames de verre de chambre pré-enduites de la couche nourricière d'astrocytes à une densité de 1 × 105 cellules / puits. Les cellules ont été cultivées pendant 50 jours dans un milieu de maturation neuronale constitué de Neurobasal Plus Medium (Thermo Fisher Scientific) additionné de B-27 Plus Supplement (Thermo Fisher Scientific), GlutaMAX (Thermo Fisher Scientific), Culture One Supplement (Thermo Fisher Scientific), et acide L-ascorbique (200 μM) (Sigma – Aldrich). Pour le test de stimulation neuronale, du chlorure de potassium a été ajouté à une concentration de 50 mM et est resté dans le milieu de culture pendant 6 h. Pour le test de silençage neuronal, un mélange de trois médicaments (butorphanol [Vetorphale], Meiji Seika Pharma Co., Ltd., Tokyo, Japon ; chlorhydrate de médétomidine [Domitor], Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd., Fukushima, Japon ; midazolam , Sandoz KK, Tokyo, Japon) a été ajouté à deux concentrations : 12/3/10 μM (faible concentration) et 30/7,5/25 μM (forte concentration)61,62.

Des souris NOD-SCID femelles âgées de huit semaines (Oriental Yeast Co., Ltd., Tokyo, Japon) ont subi une SCI ou une chirurgie factice (le poids des souris SCI avant la SCI variait de 15, 92 à 20, 55 g). Pour déterminer l'effet thérapeutique de la transplantation sur la fonction motrice, 30 animaux ont été assignés au groupe de transplantation (TP) ESAL-NS/PC, au groupe d'injection de PBS (PBS) ou au groupe de chirurgie factice (Sham) en utilisant la méthode de loterie aléatoire (c'est-à-dire, des morceaux de papier individuels avec les numéros 1 à 30 ont été placés dans une boîte, et des morceaux de papier ont été tirés au sort pour chaque groupe : groupe TP, n = 14 ; groupe PBS, n = 12 ; groupe fictif, n = 4). Le groupe TP a reçu une injection d'AAV à la semaine 1 et a subi des mesures luminescentes longitudinales (le poids des souris TP et PBS variait de 15,07 à 19,69 g à la semaine 0, de 15,00 à 20,75 g à la semaine 3, de 16,26 à 22,86 g à la semaine 6, et 17,14–22,43 g à la semaine 9). De plus, certaines souris TP (n = 12) ont préalablement subi des injections SCI, TP et AAV 6 semaines après TP. Nous avons effectué des mesures de luminescence uniquement au cours de la semaine 10. Les souris transduites ESAL et hM3Dq transduites NS/PC (hM3Dq [+] TP, n = 5) ont subi des mesures de contrôle positif au cours de la semaine 6 (des données étaient disponibles pour n = 3). En revanche, d'autres souris TP (hM3Dq [−] TP, n = 5) ont subi des mesures de contrôle négatif à la semaine 6 (des données étaient disponibles pour n = 4) et une évaluation de l'influence de l'anesthésie longue sur les greffes aux semaines 6 et 9. Toutes les expérimentations animales ont été approuvées par le comité d'éthique de l'Université de Keio et réalisées conformément au Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire (National Institutes of Health, MD, USA).

Des souris femelles NOD-SCID âgées de huit semaines ont été anesthésiées par des injections intrapéritonéales de kétamine (60 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg). Aucune analgésie supplémentaire au-delà de la kétamine n'a été administrée. Sous anesthésie par inhalation à l'aide d'isoflurane (1–2%) et d'O2, l'arc laminal des vertèbres au niveau C4 a été retiré et la surface dorsale de la dure-mère a été exposée. Un couteau en fil de tungstène (McHugh Milieux, David Kopf Instruments, CA, USA) a été inséré à 0,6 mm de la surface dorsale et relevé de 0,5 mm pour sectionner la colonne dorsale31. Neuf jours après la blessure, 5 × 105 NS/PC par 2 μl ont été transplantés dans la zone lésée à un débit de 1 μl/min à l'aide d'une aiguille métallique avec une seringue Hamilton de 10 μl et d'un microinjecteur stéréotaxique (KDS 310 ; Muromachi Kikai, Tokyo, Japon) (souris transplantées ESAL-NS/PC, total n = 31 ; souris transplantées NS/PC transduites ESAL et hM3Dq, n = 5). La seringue a été laissée au site d'injection pendant 2 minutes après l'injection avant d'être retirée. Un volume égal de PBS a été injecté à la place dans des souris témoins (souris du groupe PBS, n = 12). Les souris fictives ont subi une laminectomie de la colonne cervicale C4 (souris du groupe fictif, n = 4). La température corporelle a été maintenue à 37 ° C en plaçant les souris sur une plaque chauffante numérique. Nous avons administré par voie intramusculaire 12,5 mg/kg d'ampicilline aux animaux le jour de l'opération et le lendemain de la SCI. Nous n'avons pas effectué de soins intensifs après la SCI parce que les animaux ont pu accéder à la nourriture et à l'eau par eux-mêmes malgré l'influence négative sur le mouvement des membres antérieurs. Les animaux ont été gardés pendant une période de suivi de 10 semaines puis sacrifiés ; la période était de 6 semaines pour les souris NS/PC transduites par ESAL et hM3Dq (hM3Dq [+] TP ; n = 3 ; deux animaux sont morts avant 6 semaines).

Pour les expériences de transplantation, un traitement par inhibiteur de la gamma-sécrétase (GSI) a été appliqué la veille de la transplantation comme décrit précédemment21. En bref, les NS/PC ont été cultivés avec une petite molécule GSI, le N-[N-(3,5-difluorophénacétyl)-L-alanyl]-S-phénylglycine t-butyl ester (DAPT ; Sigma–Aldrich, MO, USA) , dissous dans du DMSO à une concentration finale de 10 μM, pendant un jour avant la transplantation dans le site de la blessure.

Les analyses ci-dessous ont été effectuées au cours des semaines 3, 6 et 9. L'expérimentateur a été aveuglé aux groupes de traitement à tout moment pendant les expériences comportementales.

Le test de force de préhension est une méthode acceptée pour évaluer la fonction des membres antérieurs. La récupération de la fonction motrice après une greffe de cellules ou une injection de PBS a été évaluée en fonction de la capacité de l'animal à exercer une force de traction63,64,65 (groupe TP ; n = 13, groupe d'injection de PBS ; n = 10 au moment final de semaine 9). L'essai consistait en cinq tirages distincts. Les forces les plus élevées et les plus faibles ont été exclues, et les trois forces restantes ont été moyennées66. Les mesures de force ont également été divisées par le poids corporel67,68. Le test de force de préhension a été effectué à l'aide d'un dynamomètre numérique (Shimpo, Kyoto, Japon) et d'un dispositif de fixation en treillis métallique (Muromachi Kikai).

Pour évaluer l'altération des membres antérieurs, en particulier la fonction CST, le score IBB de la souris a été utilisé selon les méthodes de la tâche de manipulation des aliments d'Irvine, Beatties et Bresnahan avec une légère modification69,70,71. En bref, les souris ont été acclimatées à l'environnement tous les jours pendant 10 jours après la SCI. Des céréales en forme de beignet et à saveur de miel (Honey Nut Cheerios, MN, USA) ont été données, et les mouvements des membres antérieurs ont été enregistrés avec une caméra (GoPro, CA, USA) à 120 f/s dans la cage d'accueil (groupe TP, n = 13 ; groupe d'injection de PBS, n = 10 ; groupe fictif, n = 4 au dernier moment de la semaine 9).

La tâche de marche en échelle horizontale (Conduct Science, MA, USA) mesurait le placement des pattes sur des échelons espacés de manière irrégulière72,73. Pour évaluer la marche habile, les erreurs à chaque croisement ont été comptées. Avant SCI, nous avons formé des souris en utilisant un schéma régulier d'échelons 20 min par jour pendant cinq jours pour les habituer. Une caméra (GoPro) a été positionnée à un léger angle ventral pour enregistrer les quatre membres à 60 f/s. Le modèle des échelons espacés de manière irrégulière a été modifié toutes les 3 semaines pour empêcher les animaux d'apprendre le modèle et de compenser les déficiences par l'apprentissage. Le début a été défini comme le moment où la souris a placé les quatre membres sur les échelons, et la fin a été définie comme le moment où la souris a atteint le dernier échelon de l'échelle. Le premier pas après l'interruption n'a pas été noté.

Pour étudier rigoureusement si l'activation de CST altérait l'activité des greffes neurales au cours de la semaine 10, AAV2-hsyn-hM3Dq-mCherry (Addgene #50474-AAV2 ; 7,38 × 1012 vg/ml) a été injecté dans le cortex sensorimoteur bilatéral à quatre sites (500 nL /point ; coordonnées = 1 mm rostral et 1,4 mm latéral au bregma, 1 mm postérieur et 1 mm latéral au bregma ; profondeur = 0,7 mm) à un débit de 100 nL/minute à travers une micropipette en verre tirée (micropipette calibrée, 1 –5 μL ; Funakoshi, Tokyo, Japon) à la semaine 6 (souris préliminaires transplantées ESAL-NS/PC [n = 12]). Pour étudier l'association entre le mouvement du membre supérieur et l'altération de l'activité du greffon après l'activation du CST, AAV2-hsyn-hM3Dq-mCherry a été injecté dans le cortex sensorimoteur bilatéral à deux sites (500 nL/point ; coordonnées = 1 mm rostral et 1,4 mm latéral au bregma; profondeur = 0,7 mm) à la semaine 1 (souris ESAL-NS/PC transplantées pour les mesures luminescentes longitudinales [n = 14]). Le CNO (Enzo Life Sciences, NY, USA) a été administré par voie intrapéritonéale à une concentration de 5 mg/kg. Pour manipuler le CST, un total de 26 souris transplantées ESAL-NS/PC ont subi un marquage antérograde des axones CST avec hM3Dq. Pour être inclus dans les analyses d'intégration entre le CST hôte et le greffon, les axones du CST devaient être sectionnés avec succès et marqués selon l'immunohistochimie, et le greffon devait être clairement détecté sur la colonne cervicale par comptage de photons BLI (aux semaines 3, 6 , et 9). Sur les 12 animaux préliminaires, un animal a été exclu en raison de la mort avant la mesure finale, et un animal a été exclu en raison d'un mauvais étiquetage CST (n = 10 disponibles). Sur les 14 animaux longitudinaux, deux animaux ont été exclus en raison de la mort et deux animaux ont été exclus en raison d'un mauvais étiquetage CST (n = 10 disponibles). La transsection CST a été considérée comme réussie pour toutes les autres souris selon les résultats immunohistochimiques74.

Les images de bioluminescence ont été acquises à l'aide du système IVIS Spectrum (Perkin Elmer, MA, USA). Pour les neurones cultivés in vitro, la bioluminescence a été mesurée immédiatement après le traitement avec 300 µM d'AkaLumine-HCl (FUJIFILM Wako Pure Chemical, Osaka, Japon). Les souris transplantées NS / PC doublement infectées ont été imagées à la semaine 6. Les souris transplantées ESAL-NS / PC ont été imagées aux semaines 6 et 9 ou à la semaine 10-11 sous anesthésie par inhalation (2% d'isoflurane et oxygène) ou sous un mélange de trois types d'anesthésie (5 mg/kg de butorphanol, 0,75 mg/kg de chlorhydrate de médétomidine et 4 mg/kg de midazolam)75 pendant 9 h, suivi d'une inhalation d'isoflurane à 2 % et d'oxygène (les mesures de luminescence ont été évaluées à la semaine 3 , 6 et 9 sans 9 h d'anesthésie). Dans chaque série d'expériences, les mesures ont été effectuées à la même heure d'une journée pour toutes les souris. Pour l'activation de hM3Dq, chez tous les animaux, une solution de CNO a été injectée 7 h avant la mesure. Le signal a été mesuré pendant 15 minutes après l'injection intrapéritonéale de 50 μl d'AkaLumine-HCl (60 mM) et d'une solution saline. La région d'intérêt (ROI) a été fixée immédiatement au-dessus de la moelle cervicale et l'intensité maximale, observée à environ 10 min dans la plupart des cas, a été enregistrée. Les paramètres de mesure étaient les suivants : in vitro ; temps d'exposition = 1 s, binning = 8, champ de vision = 13,4 cm et f/stop = 1 ; invivo; temps d'exposition = 60 s, binning = 8, champ de vision = 23 cm et f/stop = 1. Toutes les images ont été traitées avec le logiciel Living Image (IVIS Imaging Systems, version 4.5.5), et l'intensité du signal est exprimée comme le nombre de photons en unités de photons/seconde/cm2/stéradian. Chaque résultat est affiché sous la forme d'une image pseudo-colorée de comptage de photons superposée à une image anatomique en niveaux de gris.

Les tissus d'hippocampe isolés d'embryons de souris E17 ont été disséqués en petits morceaux et digérés avec 10 unités / ml de papaïne (Nacalai Tesque, Tokyo, Japon) et 0, 01% de DNase I (Sigma – Aldrich) dans du PBS à 37 ° C pendant 15 min. Ensuite, les neurones hippocampiques ont été cultivés (3 × 105 cellules) sur des plaques à 24 puits recouvertes de poly-L-lysine dans du milieu Neurobasal Plus contenant du B27 Plus et du GlutaMAX. Les cellules ont été infectées avec le lentivirus-E-SARE-Venus-AkaLuc-PEST sur DIV5, réduites au silence avec TTX (1 µM, Tocris, Bristol, UK) sur DIV7 puis stimulées avec 4AP (250 µM, Tocris) et bicuculline (50 µM , Sigma-Aldrich) en l'absence de TTX pendant 10 min sur DIV8 selon les méthodes des études précédentes13,76. Après stimulation, les neurones ont été à nouveau réduits au silence avec un milieu contenant 1 μM de TTX pour supprimer une stimulation prolongée. À des moments désignés (0, 2, 4, 6, 8, 10 et 24 h après une brève stimulation), des images de bioluminescence ont été acquises à l'aide du système IVIS Spectrum immédiatement après le traitement avec 300 µM AkaLumine-HCl.

L'ARN total a été extrait à l'aide d'un kit RNeasy Micro (Qiagen, Inc., Hilden, Allemagne) et l'ADNc a été synthétisé par transcription inverse avec ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (Toyobo Co., Ltd., Département des sciences de la vie, Osaka, Japon ). La qPCR a été réalisée à l'aide d'un instrument Step One Plus (Applied Biosystems, CA, USA) en suivant les instructions du fabricant. Les niveaux d'expression de chaque gène ont été normalisés à ceux de l'ACTB en utilisant la méthode comparative ΔΔCT. Nous avons utilisé les amorces fabriquées suivantes (Thermo Fisher Scientific) contre des séquences d'ADN humain : FOS (Hs01119266_g1), ARC (Hs01045540_g1) et ACTB (Hs03023943_g1). De plus, EGFP (Mr00660654_cn) a été utilisé pour détecter l'expression de Vénus.

Les cellules cultivées in vitro ont été fixées avec du paraformaldéhyde (PFA) à 4 % pendant 15 min. Toutes les souris ont été profondément anesthésiées et perfusées par voie transcardiaque avec 4 % de PFA 10 semaines après la blessure. Le cerveau et la moelle épinière ont été disséqués et postfixés dans du PFA à 4 % pendant 2 jours. Ensuite, les moelles épinières fixées ont été trempées dans du saccharose à 10 % dans du PBS 0,1 M pendant une nuit à 4 °C, puis dans du saccharose à 30 %. Les moelles épinières disséquées ont été incluses dans un composé à température de coupe optimale (Sakura Finetek, Tokyo, Japon) et sectionnées dans le plan axial à une épaisseur de 12 μm sur un cryostat (Leica Biosystems, Wetzlar, Allemagne). Les échantillons ont été colorés avec les anticorps primaires suivants : anti-GFP (goat IgG, 1:500, Rockland, PA, USA), anti-mCherry (lapin IgG, 1:400, Abcam, Cambridge, UK), anti-panembryonic lethal vision anormale semblable (ELAVL) (souris IgG1, 1:200, Sigma–Aldrich), anti-GFAP (lapin IgG, 1:2000, Proteintech, IL, USA), anti-APC (souris IgG2b, 1:300, Abcam ), anti-GFAP humain (IgG1 de souris, 1:2000, Takara Bio), anti-CNPase (IgG1 de souris, 1:2000, Sigma–Aldrich), anti-Ki-67 (IgG de lapin, 1:2000, Leica Biosystems) , anti-Nestin (IgG de lapin, 1 200, IBL, Gunma, Japon), anti-HNA (IgG1 de souris, 1 : 100, Millipore, Darmstadt, Allemagne), anti-Fos (IgG de lapin, 1 : 400, Abcam) , anti-humain pan-ELAVL (IgG humaine, 1:1000, un don du Dr Robert Darnell, The Rockefeller University, NY, USA), anti-synaptophysine (souris IgM, 1:100, Millipore), anti-pan- AMPAR (cobaye, 1:500, Frontier Institute, Hokkaido, Japon) et anti-STEM121 (souris IgG1, 1:200, Takara Bio). Les noyaux ont été colorés avec Hoechst 33258 (10 μg/ml, Sigma-Aldrich). Toutes les images ont été obtenues à l'aide d'un microscope à fluorescence (BZ-X710 ; Keyence, Osaka, Japon/THUNDER Imager Live Cell ; Leica, Allemagne) ou d'un microscope confocal à balayage laser (LSM 780 ; Carl Zeiss, Jena, Allemagne).

Des analyses quantitatives des coupes de tissus après une lésion médullaire et une transplantation ont été réalisées35. Des analyses tridimensionnelles du volume Venus+ (activité du greffon)/volume HNA+ (cellules humaines) ont été réalisées comme suit. Des coupes axiales ont été préparées à partir de huit animaux ayant subi une transplantation NS/PC transduite par ESAL et un marquage antérograde sur quatre sites (4 souris ont été sacrifiées 7 h après l'administration de CNO et 4 souris ont été sacrifiées sans CNO), et la zone Venus+ et la zone HNA+ ont été déterminé à l'aide d'ImageJ. Le volume a ensuite été calculé par l'équation suivante :

où A1 et A2 sont les aires de deux sections consécutives et h est la distance entre elles (480 μm).

La quantification de la synapse entre les axones CST et les neurones greffés a été réalisée en combinaison avec une macro personnalisée à l'aide d'ImageJ (ver. 2.1.0/1.53.c). Le nombre de marqueurs présynaptiques (synaptophysine) fusionnés avec les terminaux d'axones CST marqués mCherry intégrés dans la zone STEM121 + a été compté.

La procédure détaillée utilisée pour les analyses microscopiques immunoélectroniques de pré-enrobage a été décrite précédemment77. En bref, des sections de moelle épinière congelées sur des lames de verre ont été décongelées, séchées et autoclavées dans un tampon acide citrate (pH 6,0) avant le traitement de blocage (solution Block Ace à 5,0 % [DS Pharma Biomedical, Osaka, Japon] avec 0,01 % de saponine dans 0,1 M PB) . Les échantillons ont été colorés avec les anticorps primaires anti-GFP (IgG de chèvre, 1:100, Rockland) et anti-mCherry (IgG de lapin, 1:100, Abcam) et les anticorps secondaires anti-biotine de lapin (IgG d'âne, 1:800 , Jackson ImmunoResearch, Pennsylvanie, États-Unis). Après lavage au PBS, un anticorps IgG de lapin anti-chèvre conjugué Alexa Fluor 488—FluoroNanogold™ (1:100, Nanoprobes, NY, USA) a été appliqué avant la coloration avec Hoechst 33258. Nous avons utilisé les suppléments suivants : complexe ABC (VECTASTAIN Elite ABC Kit ; Vector, CA, USA), biotine TSA Plus (NEL749A001KT ; PerkinElmer, MA, USA), SA-Alexa Fluor 555 (1:1000, Thermo Fisher Scientific), SA-HRP (1:100, Vector) et 3,3 Comprimés de ′-diaminobenzidine (DAB) (FUJIFILM Wako Pure Chemical). Des coupes ultrafines (épaisseur de 80 nm) ont été préparées avec un couteau en diamant, collectées sur des grilles en maille de cuivre (#100 ou #150 Veco, Nisshin EM, Tokyo, Japon) et colorées avec de l'acétate d'uranyle et du citrate de plomb dans des tubes en plastique pendant 10 min chaque. Les coupes ont été examinées au microscope électronique à transmission (TEM, JEM-1400Plus, JEOL, Tokyo, Japon) à 100 keV.

Pour les comparaisons entre deux groupes, un test t de Student bilatéral a été utilisé. Une ANOVA à mesures répétées a été utilisée pour les analyses des données de la Fig. 2h et des Fig. 4a, c supplémentaires. L'ANOVA à mesures répétées bidirectionnelles a été utilisée pour les analyses des données de la Fig. 2a – c supplémentaire. Pour toutes les analyses statistiques, les différences ont été considérées comme significatives à p < 0,05. Toutes les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM. Pour tous les calculs, SPSS Statistics (Japan IBM, Tokyo, Japan. ver. 26) a été utilisé. Le logiciel SAS (SAS Institute, NC, USA. ver. 9.4) a également été utilisé pour l'ANOVA à mesures répétées. Comme il s'agissait d'une étude exploratoire, nous avons utilisé un petit nombre d'échantillons qui n'étaient peut-être pas adéquats. La taille d'échantillon appropriée a été calculée à l'aide des calculateurs d'outils statistiques CRAB SWOG (https://stattools.crab.org). Le critère d'évaluation principal de l'étude était l'altération du nombre de photons BLI du greffon de l'activation pré- à post-CST 10 semaines après TP (Fig. 4l). Une analyse de puissance post hoc réalisée avec l'ensemble de données de la Fig. 4l a révélé que n = 11 souris transplantées étaient suffisantes pour atteindre le critère d'évaluation principal avec une puissance de 0, 8 (One Arm Normal). Le d de Cohen a été calculé pour mesurer la taille de l'effet. Nous définissons la taille de l'effet comme étant grande si la valeur d était > 0,878,79. La taille des échantillons du groupe PBS et du groupe fictif dans la Fig. 2 supplémentaire a été déterminée avant l'étude, le test de force de préhension étant utilisé comme critère principal. L'analyse de puissance a priori a révélé que n = 27 souris au total étaient suffisantes avec une puissance de 0,8 (Two Arm Normal). Les analyses IBB et échelle horizontale ont été considérées comme secondaires.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Les données sources ont été incluses en tant que données supplémentaires 1. Les données restantes qui appuient les résultats sont disponibles auprès des auteurs correspondants sur demande raisonnable.

Assinck, P., Duncan, GJ, Hilton, BJ, Plemel, JR et Tetzlaff, W. Thérapie de transplantation cellulaire pour les lésions de la moelle épinière. Nat. Neurosci. 20, 637–647 (2017).

Article CAS PubMed Google Scholar

Cummings, BJ et al. Les cellules souches neurales humaines se différencient et favorisent la récupération locomotrice chez les souris blessées à la moelle épinière. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 102, 14069–14074 (2005).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Iwanami, A. et al. Transplantation de cellules souches neurales humaines pour les lésions de la moelle épinière chez les primates. J. Neurosci. Rés. 80, 182-190 (2005).

Article CAS PubMed Google Scholar

Kamata, Y. et al. Un système de culture robuste pour générer des progéniteurs neuronaux avec une compétence gliogénique à partir de cellules souches pluripotentes induites cliniquement pertinentes pour le traitement des lésions de la moelle épinière. Cellules souches Trad. Méd. 10, 398–413 (2021).

Article CAS PubMed Google Scholar

Keirstead, HS et al. Les greffes de cellules progénitrices d'oligodendrocytes embryonnaires humaines dérivées remyélinisent et rétablissent la locomotion après une lésion de la moelle épinière. J. Neurosci. 25, 4694–4705 (2005).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yasuda, A. et al. Signification de la remyélinisation par les cellules souches/progénitrices neurales transplantées dans la moelle épinière lésée. Cellules souches 29, 1983–1994 (2011).

Article PubMed Google Scholar

Lu, P. et al. Croissance à longue distance et connectivité des cellules souches neurales après une lésion grave de la moelle épinière. Cellule 150, 1264-1273 (2012).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kumamaru, H. et al. Génération et intégration post-lésionnelle de cellules souches neurales de la moelle épinière humaine. Nat. Méthodes 15, 723–731 (2018).

Article CAS PubMed Google Scholar

Ceto, S., Sekiguchi, KJ, Takashima, Y., Nimmerjahn, A. & Tuszynski, MH Les greffes de cellules souches neurales forment de vastes réseaux synaptiques qui s'intègrent aux circuits hôtes après une lésion de la moelle épinière. Cellule souche cellulaire 27, 430–440.e435 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Iwano, S. et al. Imagerie par bioluminescence unicellulaire des tissus profonds chez des animaux en mouvement libre. Sciences 359, 935–939 (2018).

Article CAS PubMed Google Scholar

Kuchimaru, T. et al. Un analogue de la luciférine générant une bioluminescence dans le proche infrarouge permet d'obtenir une imagerie très sensible des tissus profonds. Nat. Commun. 7, 11856 (2016).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hara-Miyauchi, C. et al. Système bioluminescent pour l'imagerie dynamique du comportement cellulaire et animal. Biochimie. Biophys. Rés. Commun. 419, 188-193 (2012).

Article CAS PubMed Google Scholar

Kawashima, T. et al. Marquage fonctionnel des neurones et de leurs projections à l'aide du promoteur synthétique dépendant de l'activité E-SARE. Nat. Méthodes 10, 889–895 (2013).

Article CAS PubMed Google Scholar

Bonner, JF et al. Les progéniteurs neuronaux greffés intègrent et restaurent la connectivité synaptique à travers la moelle épinière lésée. J. Neurosci. 31, 4675–4686 (2011).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Guzowski, JF, McNaughton, BL, Barnes, CA & Worley, PF Expression spécifique à l'environnement du gène Arc immédiat-précoce dans les ensembles neuronaux hippocampiques. Nat. Neurosci. 2, 1120-1124 (1999).

Article CAS PubMed Google Scholar

Li, X. et al. Génération de protéine fluorescente verte déstabilisée en tant que rapporteur de transcription. J. Biol. Chim. 273, 34970–34975 (1998).

Article CAS PubMed Google Scholar

Nagai, T. et al. Une variante de la protéine fluorescente jaune avec une maturation rapide et efficace pour des applications en biologie cellulaire. Nat. Biotechnol. 20, 87–90 (2002).

Article CAS PubMed Google Scholar

Tsuji, O. et al. Potentiel thérapeutique des cellules souches pluripotentes induites sûres évaluées de manière appropriée pour les lésions de la moelle épinière. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 107, 12704–12709 (2010).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nori, S. et al. Des neurosphères dérivées de cellules souches pluripotentes induites par l'homme greffées favorisent la récupération fonctionnelle motrice après une lésion de la moelle épinière chez la souris. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 108, 16825–16830 (2011).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nakamura, M. & Okano, H. Thérapies de transplantation cellulaire pour les lésions de la moelle épinière axées sur les cellules souches pluripotentes induites. Cell Res 23, 70–80 (2013).

Article CAS PubMed Google Scholar

Okubo, T. et al. Le prétraitement avec un inhibiteur de la γ-sécrétase empêche la prolifération tumorale dans les greffes humaines dérivées d'iPSC pour les lésions de la moelle épinière. Stem Cell Rep. 7, 649–663 (2016).

Article CAS Google Scholar

Nichols, CD & Roth, BL Les récepteurs couplés aux protéines G d'ingénierie sont des outils puissants pour étudier les processus et les comportements biologiques. Avant Mol. Neurosci. 2, 16 (2009).

Article PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Roth, BL et al. DREADD pour les neuroscientifiques. Neurone 89, 683–694 (2016).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chen, B. et al. Réactivation des voies de relais dormantes dans la moelle épinière blessée par KCC2 Manipulations. Cellule 174, 521–535.e513 (2018).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Courtine, G. et al. Transformation des circuits spinaux non fonctionnels en états fonctionnels après la perte de l'apport cérébral. Nat. Neurosci. 12, 1333-1342 (2009).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kadoya, K. et al. La reconstitution de la moelle épinière avec des greffes neurales homologues permet une régénération corticospinale robuste. Nat. Méd. 22, 479–487 (2016).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hu, X. et al. Les variantes d'AAV criblées permettent un accès de transduction efficace aux cellules de soutien et aux cellules ciliées. Cellule découverte. 5, 49 (2019).

Article PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Alexandre, GM et al. Contrôle à distance de l'activité neuronale chez des souris transgéniques exprimant des récepteurs évolués couplés aux protéines G. Neurone 63, 27–39 (2009).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Campbell, EJ & Marchant, NJ L'utilisation de la chimiogénétique dans les neurosciences comportementales : variantes de récepteurs, approches de ciblage et mises en garde. Br. J.Pharm. 175, 994-1003 (2018).

Article CAS Google Scholar

Guettier, JM et al. Une approche chimico-génétique pour étudier la régulation par la protéine G de la fonction des cellules bêta in vivo. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 106, 19197–19202 (2009).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kadoya, K. et al. La reconstitution de la moelle épinière avec des greffes neurales homologues permet une régénération corticospinale robuste. Nat. Méd. 22, 479–487 (2016).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dell'Anno, MT et al. La spécificité régionale des cellules souches neuroépithéliales humaines permet la réparation de la moelle épinière via un circuit de relais. Nat. Commun. 9, 3419 (2018).

Article PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Nori, S., Nakamura, M. & Okano, H. Plasticité et régénération dans la moelle épinière lésée après une thérapie de transplantation cellulaire. Programme. Cerveau Res. 231, 33-56 (2017).

Article PubMed Google Scholar

Wilson, ES Modèles de cellules souches du développement et de la dégénérescence des synapses humaines. Mol. Biol. Cellule 29, 2913-2921 (2018).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kajikawa, K. et al. Thérapie cellulaire pour les lésions de la moelle épinière à l'aide de cellules progénitrices neurales spécifiques à la région dérivées d'iPSC humaines. Mol. Cerveau 13, 120 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Watanabe, K. et al. Comparaison entre les cellules souches / progénitrices neurales dérivées de la moelle épinière fœtale et du cerveau antérieur comme source de transplantation pour les lésions de la moelle épinière. Dév. Neurosci. 26, 275-287 (2004).

Article CAS PubMed Google Scholar

Ito, S. et al. LOTUS inhibe l'apoptose neuronale et favorise la régénération des voies chez des souris modèles de lésions médullaires contusives. eNeuro 5, https://doi.org/10.1523/eneuro.0303-18.2018 (2018).

Suzuki, K. et al. Une protéine synaptique organisatrice synthétique restaure les circuits neuronaux glutamatergiques. Science 369, https://doi.org/10.1126/science.abb4853 (2020).

Lemon, RN & Griffiths, J. Comparaison de la fonction du système corticospinal chez différentes espèces : différences organisationnelles pour la spécialisation motrice. Nerf musculaire 32, 261–279 (2005).

Article PubMed Google Scholar

Welniarz, Q., Dusart, I. & Roze, E. Le tractus corticospinal : évolution, développement et troubles humains. Dév. Neurobiol. 77, 810–829 (2017).

Article PubMed Google Scholar

Attwell, CL, van Zwieten, M., Verhaagen, J. & Mason, MRJ Le modèle de lésion de la colonne dorsale d'une lésion de la moelle épinière et son utilisation pour déchiffrer la réponse de lésion neuronale intrinsèque. Dév. Neurobiol. 78, 926–951 (2018).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Schrimsher, GW & Reier, PJ Performances motrices des membres antérieurs suite à des lésions de la colonne dorsale, des funicules dorsolatéraux ou des funicules ventrolatéraux de la moelle épinière cervicale chez le rat. Exp. Neurol. 120, 264-276 (1993).

Article CAS PubMed Google Scholar

Ballermann, M. & Fouad, K. La récupération locomotrice spontanée chez les rats blessés à la moelle épinière s'accompagne d'une plasticité anatomique des fibres réticulospinales. EUR. J. Neurosci. 23, 1988–1996 (2006).

Article PubMed Google Scholar

Citron, RN Voies descendantes dans le contrôle moteur. Annu. Rév. Neurosci. 31, 195-218 (2008).

Article CAS PubMed Google Scholar

Kawai, M. et al. La stimulation sélective à long terme des cellules souches/progénitrices neurales transplantées pour les lésions de la moelle épinière améliore la fonction locomotrice. Cell Rep. 37, 110019 (2021).

Article CAS PubMed Google Scholar

Van Steenbergen, V. & Bareyre, FM Approches chimiogénétiques pour démêler le câblage des circuits et le comportement associé après une lésion de la moelle épinière. Exp. Neurol. 345, 113839 (2021).

Article PubMed CAS Google Scholar

Kitagawa, T. et al. La modulation par DREADD révèle l'effet thérapeutique de l'activité neuronale dérivée de l'iPSC humain sur la récupération fonctionnelle après une lésion de la moelle épinière. Stem Cell Rep. 17, 127–142 (2022).

Article CAS Google Scholar

Oh, Y. et al. Un indicateur bioluminescent orange modulé en calcium pour l'imagerie d'activité non invasive. Nat. Chim. Biol. 15, 433–436 (2019).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Edinger, M. et al. Évaluation non invasive de la prolifération des cellules tumorales dans des modèles animaux. Néoplasie 1, 303–310 (1999).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Su, Y. et al. Les nouveaux substrats NanoLuc permettent une imagerie lumineuse par bioluminescence à deux populations chez les animaux. Nat. Méthodes 17, 852–860 (2020).

Article CAS PubMed Google Scholar

Schilling, K., Luk, D., Morgan, JI & Curran, T. Régulation d'un gène de fusion fos-lacZ : un paradigme pour l'analyse quantitative du couplage stimulus-transcription. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 88, 5665–5669 (1991).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lucibello, FC, Lowag, C., Neuberg, M. & Müller, R. trans-répression du promoteur c-fos de souris : un nouveau mécanisme de trans-régulation médiée par Fos. Cellule 59, 999-1007 (1989).

Article CAS PubMed Google Scholar

Morgan, JI & Curran, T. Facteurs de transcription proto-oncogènes et épilepsie. Tendances Pharm. Sci. 12, 343–349 (1991).

Article CAS PubMed Google Scholar

Tervo, DG et al. Une variante AAV de concepteur permet un accès rétrograde efficace aux neurones de projection. Neurone 92, 372–382 (2016).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sakai, K., Mitani, K. et Miyazaki, J. Régulation efficace de l'expression génique par la délivrance médiée par un vecteur adénoviral de la recombinase CRE. Biochimie. Biophys. Rés. Commun. 217, 393–401 (1995).

Article CAS PubMed Google Scholar

Kojima, K. et al. Ablation sélective de cellules tumorigènes à la suite d'une greffe de cellules souches/progénitrices neurales dérivées de cellules souches pluripotentes induites par l'homme dans une lésion de la moelle épinière. Cellules souches Trad. Méd. 8, 260-270 (2019).

Article CAS PubMed Google Scholar

Iida, T. et al. Les analyses de méthylation de l'ADN du génome entier ont révélé une instabilité épigénétique dans les cellules souches/progénitrices neurales dérivées de cellules iPS humaines tumorigènes. Cellules souches 35, 1316–1327 (2017).

Article CAS PubMed Google Scholar

Miyoshi, H., Blömer, U., Takahashi, M., Gage, FH & Verma, IM Développement d'un vecteur de lentivirus auto-inactivant. J. Virol. 72, 8150–8157 (1998).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Okita, K. et al. Une méthode plus efficace pour générer des cellules iPS humaines sans intégration. Nat. Méthodes 8, 409–412 (2011).

Article CAS PubMed Google Scholar

Okada, Y. et al. Récapitulation spatio-temporelle du développement du système nerveux central par des cellules souches/progénitrices neurales dérivées de cellules souches embryonnaires murines. Cellules souches 26, 3086–3098 (2008).

Article CAS PubMed Google Scholar

Hsiao, G. et al. Mécanismes de l'activité antiplaquettaire et antithrombotique du midazolam dans des études in vitro et in vivo. EUR. J.Pharm. 487, 159-166 (2004).

Article CAS Google Scholar

Wang, C. et al. Le midazolam et la dexmédétomidine affectent la biologie cellulaire des neurogliomes et des carcinomes pulmonaires in vitro et in vivo. Anesthésiologie 129, 1000–1014 (2018).

Article CAS PubMed Google Scholar

Anderson, KD, Gunawan, A. & Steward, O. Évaluation quantitative de la fonction motrice des membres antérieurs après une lésion de la moelle épinière cervicale chez le rat : relation avec le tractus corticospinal. Exp. Neurol. 194, 161-174 (2005).

Article PubMed Google Scholar

Anderson, KD, Gunawan, A. & Steward, O. Voies vertébrales impliquées dans le contrôle de la fonction motrice des membres antérieurs chez le rat. Exp. Neurol. 206, 318–331 (2007).

Article PubMed Google Scholar

Aguilar, RM & Steward, O. Un modèle de blessure par contusion cervicale bilatérale chez la souris : évaluation de la force de préhension comme mesure de la fonction motrice des membres antérieurs. Exp. Neurol. 221, 38-53 (2010).

Article PubMed Google Scholar

Forgione, N., Chamankhah, M. & Fehlings, MG Un modèle murin de lésion bilatérale de la moelle épinière par contusion cervicale-compression. J. Neurotrauma 34, 1227-1239 (2017).

Article PubMed Google Scholar

Cozzoli, A. et al. GLPG0492, un nouveau modulateur sélectif des récepteurs aux androgènes, améliore les performances musculaires chez le modèle murin mdx exercé de la dystrophie musculaire. Pharm. Rés. 72, 9-24 (2013).

Article CAS Google Scholar

Dougherty, BJ et al. Résultats respiratoires après transplantation mi-cervicale de cellules médullaires embryonnaires chez des rats présentant une lésion de la moelle épinière cervicale. Exp. Neurol. 278, 22–26 (2016).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Irvine, KA et al. Une nouvelle méthode pour évaluer la fonction des membres antérieurs proximal et distal chez le rat : l'échelle des membres antérieurs d'Irvine, Beatties et Bresnahan (IBB). J.Vis. Exp. https://doi.org/10.3791/2246 (2010).

Irvine, KA et al. L'échelle de récupération des membres antérieurs d'Irvine, Beatties et Bresnahan (IBB): une évaluation de la fiabilité et de la validité. Neurol avant. 5, 116 (2014).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Speck, AE et al. L'échelle des membres antérieurs IBB comme outil pour évaluer la récupération fonctionnelle après une lésion du nerf périphérique chez la souris. J. Neurosci. Méthodes 226, 66–72 (2014).

Article PubMed Google Scholar

Metz, GA & Whishaw, IQ La tâche de marche à l'échelon de l'échelle : un système de notation et son application pratique. J.Vis. Exp. https://doi.org/10.3791/1204 (2009).

Yang, Q. et al. Réplication indépendante de la stimulation électrique du cortex moteur et de la moelle épinière cervicale pour favoriser la fonction motrice des membres antérieurs après une lésion de la moelle épinière chez le rat. Exp. Neurol. 320, 112962 (2019).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Renault-Mihara, F. et al. Compactage bénéfique de la lésion de la moelle épinière par migration des astrocytes par inhibition de la glycogène synthase kinase-3. EMBO Mol. Méd. 3, 682–696 (2011).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kawai, S., Takagi, Y., Kaneko, S. et Kurosawa, T. Effet de trois types d'agents anesthésiques mixtes alternant avec la kétamine chez la souris. Exp. Anim. 60, 481–487 (2011).

Article CAS PubMed Google Scholar

Sorensen, AT et al. Un système de marquage d'activité robuste pour explorer les ensembles neuronaux actifs. Elife 5, https://doi.org/10.7554/eLife.13918 (2016).

Shibata, S. et al. Imagerie corrélative par fluorescence et microscopie électronique à grande surface avec microscopie électronique à balayage multifaisceaux. Circuits neuronaux avant 13, 29 (2019).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cohen, J. Une amorce de puissance. Psychol. Taureau. 112, 155-159 (1992).

Article CAS PubMed Google Scholar

Grice, JW & Barrett, PT Une note sur les proportions de chevauchement de Cohen des distributions normales. Psychol. Rep. 115, 741–747 (2014).

Article PubMed Google Scholar

Télécharger les références

Les auteurs remercient S. Yamanaka de CiRA (Université de Kyoto) pour avoir fourni les iPSC humains 414C2. Nous remercions K. Tanaka du Département de psychiatrie (Université Keio) pour ses conseils techniques et conceptuels. Nous remercions HJ Okano et M. Hasegawa de la Division de médecine régénérative (Université Jikei) pour leur aide dans les expériences. Nous remercions Y. Sato et K. Nagashima du Département de médecine préventive et de santé publique (Université Keio) pour leurs conseils statistiques. Nous sommes reconnaissants pour l'aide de H. Miyoshi, S. Nori, O. Tsuji, S. Ito, Y. Hoshino, Y. Tanimoto, T. Shibata, S. Hashimoto, Y. Suematsu, Y. Saijyo, T. Nishijima , T. Tanaka, K. Ito, L. Tao et K. Nakanishi, qui sont tous membres de l'équipe de recherche sur la moelle épinière du Département de chirurgie orthopédique et de physiologie (Université Keio). Nous remercions également T. Harada, K. Yasutake et M. Akizawa pour leur aide dans les expériences et les soins aux animaux. Ce travail a été soutenu par l'Agence japonaise pour la recherche et le développement médicaux (AMED) (numéros de subvention JP20bm0204001, JP19bm0204001, JP20bk0104017 et JP19bk0104017 à HO et MN ; numéro de subvention JP20bm0704046 à SS et TS ; numéro de subvention JP18dm020703 6 à HB), la Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (numéro de subvention KAKENHI 22H03205 à NN ; 17H06312 à HB) et la General Insurance Association of Japan (Medical Research Grant 2018 à KA)

Département de chirurgie orthopédique, École de médecine de l'Université Keio, 35 Shinanomachi, Shinjuku-ku, Tokyo, 160-8582, Japon

Kentaro Ago, Narihito Nagoshi, Takahiro Kitagawa, Momotaro Kawai, Keita Kajikawa, Reo Shibata, Yasuhiro Kamata, Kota Kojima, Morio Matsumoto et Masaya Nakamura

Département de physiologie, École de médecine de l'Université Keio, 35 Shinanomachi, Shinjuku-ku, Tokyo, 160-8582, Japon

Kentaro Ago, Kent Imaizumi, Takahiro Kitagawa, Momotaro Kawai, Munehisa Shinozaki, Takahiro Kondo, Jun Kohyama et Hideyuki Okano

Laboratoire de la fonction et de la dynamique cellulaires, Brain Science Institute, RIKEN, 2-1 Hirosawa, Wako, Saitama, 351-0198, Japon

Satoshi Iwano et Atsushi Miyawaki

Laboratoire d'analyse moléculaire des fonctions cérébrales supérieures, Brain Science Institute, RIKEN, 2-1 Hirosawa, Wako, Saitama, 351-0198, Japon

Masanari Ohtsuka

Département de neurochimie, École supérieure de médecine, Université de Tokyo, 7-3-1 Hongo, Bunkyo-ku, Tokyo, 113-0033, Japon

Haruhiko Bito

Section du développement des vecteurs viraux, Institut national des sciences physiologiques, 38 Nishigonaka Myodaiji, Okazaki, Aichi, 444-8585, Japon

Kenta Kobayashi

Division d'anatomie microscopique, École supérieure des sciences médicales et dentaires, Université de Niigata, 1-757 Asahimachi-dori, Chuo-ku, Niigata, Niigata, 951-8510, Japon

Shinsuke Shibata

Laboratoire de microscope électronique, École de médecine de l'Université Keio, 35 Shinanomachi, Shinjuku-ku, Tokyo, 160-8582, Japon

Shinsuke Shibata et Tomoko Shindo

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

KA, NN, KI, T. Kondo, MS, SS, JK, MM, MN et HO ont conçu les expériences. KA, T. Kitagawa, MK, K. Kajikawa, RS, YK, KK et TS ont réalisé les expériences. SI, AM, MO, HB et K. Kobayashi ont préparé les plasmides ou vecteurs viraux. KA et tous les autres auteurs ont préparé le manuscrit final.

Correspondance à Narihito Nagoshi ou Hideyuki Okano.

MN déclare un rôle de consultant auprès de K-Pharma et un financement de recherche de RMic, Hisamitsu. HO déclare une position de leader à la Keio University Graduate School of Medicine et est consultant scientifique rémunéré pour San Bio Co., Ltd et K Pharma Inc. Tous les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Communications Biology remercie les relecteurs anonymes pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail. Rédacteurs en chef de la manipulation principale : Ivo Lieberam, Anam Akhtar et Karli Montague-Cardoso.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Libre accès Cet article est sous licence Creative Commons Attribution 4.0 International License, qui permet l'utilisation, le partage, l'adaptation, la distribution et la reproduction sur n'importe quel support ou format, tant que vous donnez le crédit approprié à l'auteur ou aux auteurs originaux et à la source, fournissez un lien vers la licence Creative Commons et indiquez si des modifications ont été apportées. Les images ou tout autre matériel tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons de l'article, sauf indication contraire dans une ligne de crédit au matériel. Si le matériel n'est pas inclus dans la licence Creative Commons de l'article et que votre utilisation prévue n'est pas autorisée par la réglementation légale ou dépasse l'utilisation autorisée, vous devrez obtenir l'autorisation directement du détenteur des droits d'auteur. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Réimpressions et autorisations

Ago, K., Nagoshi, N., Imaizumi, K. et al. L'invention concerne un système non invasif pour surveiller l'activité d'un greffon neuronal in vivo après une lésion de la moelle épinière. Commun Biol 5, 803 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-03736-8

Télécharger la citation

Reçu : 12 septembre 2021

Accepté : 18 juillet 2022

Publié: 10 août 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-022-03736-8

Toute personne avec qui vous partagez le lien suivant pourra lire ce contenu :

Désolé, aucun lien partageable n'est actuellement disponible pour cet article.

Fourni par l'initiative de partage de contenu Springer Nature SharedIt

En soumettant un commentaire, vous acceptez de respecter nos conditions d'utilisation et nos directives communautaires. Si vous trouvez quelque chose d'abusif ou qui ne respecte pas nos conditions ou directives, veuillez le signaler comme inapproprié.