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Nature Communications volume 13, Numéro d'article : 6909 (2022) Citer cet article

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L'émergence d'isolats de Staphylococcus aureus résistants à la méthicilline souligne le besoin urgent de développer davantage d'antibiotiques. ClpP est une protéase hautement conservée régulée par les ATPases dans les bactéries et dans les mitochondries. L'activation aberrante de la ClpP bactérienne est une méthode alternative de découverte d'antibiotiques, alors qu'il reste difficile de développer des activateurs sélectifs de la ClpP de Staphylococcus aureus qui puissent éviter de perturber les fonctions de la ClpP d'Homo sapiens. Ici, nous utilisons une conception basée sur la structure pour identifier (R)- et (S)-ZG197 comme activateurs hautement sélectifs de Staphylococcus aureus ClpP. Les éléments structuraux clés chez Homo sapiens ClpP, en particulier W146 et son action conjointe avec le motif C-terminal, contribuent significativement à la discrimination des activateurs. Nos activateurs sélectifs présentent de larges propriétés antibiotiques vis-à-vis d'un éventail de souches staphylococciques multirésistantes in vitro et démontrent une efficacité antibiotique prometteuse dans des modèles d'infection cutanée chez le poisson zèbre et la souris. Nos résultats indiquent que les activateurs spécifiques à l'espèce de Staphylococcus aureus ClpP sont des agents thérapeutiques passionnants pour traiter les infections staphylococciques.

Staphylococcus aureus (S. aureus) colonise la peau et les narines humaines et provoque fréquemment des maladies invasives et potentiellement mortelles1. Le S. aureus résistant à la méthicilline (SARM) est responsable de nombreuses infections nosocomiales, notamment les infections du site opératoire, la bactériémie et la septicémie2. Le SARM a acquis une résistance multimédicamenteuse contre de nombreux antibiotiques, notamment la β-lactamine, la céphalosporine, la fluoroquinolone, l'aminoglycoside, la tétracycline, le macrolide et le triméthoprime-sulfaméthoxazole3. En raison de cette résistance, la prophylaxie antibiotique des infections à SARM incite fréquemment à des maladies nosocomiales telles que l'infection à Clostridium difficile4. Compte tenu de la diminution de l'offre d'antibiotiques puissants, il est de plus en plus important de développer de nouvelles méthodes de traitement des infections à SARM multirésistantes5. À cette fin, le développement d'agents antistaphylococciques, en particulier ceux ayant un mode d'action différent, est nécessaire de toute urgence pour fournir de futurs traitements pour les infections à SARM6,7,8,9,10,11.

La protéase caséinolytique P (ClpP) est une protéase hautement conservée régulée par les ATPases dans les bactéries et dans les mitochondries humaines, et joue un rôle important dans le contrôle de la qualité des protéines en régulant et en dégradant les protéines mal repliées ou endommagées12,13. Chez les bactéries, la ClpP est responsable de la modulation de l'expression des facteurs de virulence, de la résistance aux antibiotiques et de la formation de biofilms et de persistants14,15,16,17. De même, Homo sapiens ClpP (HsClpP), qui se trouve dans les mitochondries, est une protéase clé régulant l'homéostasie des protéines mitochondriales. Ces protéines sont principalement impliquées dans les complexes de la chaîne respiratoire18. L'expression dérégulée ou la distribution tissulaire de HsClpP est fortement associée à des maladies telles que le cancer et les troubles neurologiques19,20.

Le dysfonctionnement de ClpP par des activateurs de petites molécules a récemment été démontré comme une méthode possible de découverte de médicaments antibactériens et anticancéreux21. Remarquablement, les acyldepsipeptides (ADEP) ont été identifiés comme une classe prometteuse d'antibiotiques, ce qui révèle que le ClpP bactérien est une cible possible d'antibiotiques22,23. Ces activateurs naturels commutent allostériquement S. aureus ClpP (SaClpP) vers un état de gain de fonction pour dégrader plusieurs protéines essentielles, telles que le Z filamenteux sensible à la température (SaFtsZ), qui inhibe la division cellulaire et conduit finalement à la mort des cellules bactériennes24 ,25. De plus, l'ADEP 4 supprime la croissance des persistants et éradique une infection chronique du biofilm lorsqu'il est combiné avec des antibiotiques commercialisés23, indiquant que l'application thérapeutique des ADEP peut être utilisée en thérapie combinée. Cependant, les problèmes d'instabilité chimique des analogues de l'ADEP pourraient restreindre considérablement les applications de la découverte d'antibiotiques26. La découverte des ADEP en tant qu'activateurs bactériens du ClpP a inspiré des études sur le HsClpP. L'activation aberrante de l'activité de la protéase HsClpP dégrade de manière significative plusieurs protéines du complexe de la chaîne respiratoire, qui exerce des effets antitumoraux27. Il convient de noter qu'il a été démontré que l'ADEP-28, un analogue de l'ADEP 4, activait HsClpP et induisait des effets cytotoxiques en activant l'apoptose intrinsèque dépendante de la caspase28. De plus, l'imipridone ONC201 et ONC212 activent la protéase HsClpP et facilitent la protéolyse médiée par le ClpP, entraînant la létalité des cellules cancéreuses27,29. ONC212 fonctionne également comme un antibiotique, qui active les ClpP d'Escherichia coli, de Bacillus subtilis et de S. aureus dans des tests biochimiques et génétiques et a finalement supprimé la prolifération des cellules bactériennes30. Récemment, nous avons découvert que ONC212 et ADEP 4 dérégulaient XooClpP pour dégrader XooFtsZ, ce qui suggère une stratégie prometteuse de traitement des maladies de la brûlure des feuilles31. D'autres activateurs, tels que les analogues de bengamide et les activateurs de protéases auto-compartimentales (ACP), présentent également certaines activités sur ClpP32,33,34. Cependant, à ce jour, il n'existe pas d'activateur spécifique d'espèce pour la protéase SaClpP.

Dans cette étude, nous rapportons deux activateurs SaClpP hautement sélectifs, (R)- et (S)-ZG197, qui activent sélectivement SaClpP plutôt que HsClpP. De plus, (R)-ZG197 présente une large gamme de propriétés antibiotiques vis-à-vis d'un éventail de souches de SARM et montre une efficacité antibiotique prometteuse in vivo.

Étant donné que ADEP 4 et ONC212 sont des activateurs globaux pour les protéases ClpP (Fig. 1a supplémentaire), notre objectif est de développer des activateurs à petites molécules qui améliorent sélectivement l'activité de la protéase SaClpP par rapport à HsClpP (Fig. 1a). Compte tenu des relations structure-activité établies d'ADEP 4 et d'ONC212 en tant qu'activateurs ClpP29,35,36,37,38, nous recherchons des échafaudages chimiques distincts en tant qu'activateurs sélectifs pour SaClpP. À cette fin, nous avons effectué un criblage à haut débit (HTS) sur une bibliothèque de composés contenant 3 896 candidats. Il a été confirmé que l'ICG-001 favorise l'hydrolyse de la caséine marquée à l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC-caséine) en présence de SaClpP (Fig. 1b et 1c supplémentaires). ICG-001 a été initialement caractérisé comme un inhibiteur de la voie de signalisation Wnt, alors qu'il a récemment été criblé comme un activateur pour HsClpP39,40. Compte tenu de l'échafaudage distinct de l'ICG-001 et de la synthèse réalisable des dérivés, nous avons choisi l'ICG-001 comme point de départ pour l'optimisation synthétique de suivi41. L'incorporation du fragment d'isoleucine et du motif 4,4,4-trifluorobutyle dans l'échafaudage central de l'ICG-001 a fourni un puissant activateur ClpP ZG180 (Fig. 1b). Le ZG180 est plus puissant que l'ICG-001 pour activer le SaClpP pour l'hydrolyse de l'α-caséine, comme en témoigne une diminution de 3 fois de l'EC50 (Fig. 1c et Fig. 1d supplémentaire). Cependant, ZG180 favorise également HsClpP pour l'hydrolyse de la caséine α (Fig. 1c et Fig. 1e supplémentaire), ce qui indique que ZG180 est également un activateur global pour les protéines ClpP bactériennes et mitochondriales.

a Le but de ce travail est de développer des activateurs sélectifs de SaClpP. b Le composé de plomb synthétique ZG180 comme activateur ClpP. c Quantification de l'hydrolyse de l'α-caséine par SaClpP et HsClpP en présence d'ICG-001 et de ZG180, respectivement (n = 3 expériences biologiquement indépendantes). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD (barres d'erreur). Structure cristalline aux rayons X des complexes ZG180/SaClpP (d) et ZG180/HsClpP (e). Les vues de côté et de dessus des complexes structuraux sont affichées. SaClpP est montré dans un tube de dessin animé gris, HsClpP est montré dans un tube de dessin animé de blé et ZG180 est montré dans une sphère cyan. f, g Les cartes de densité électronique et une vue rapprochée de la liaison de ZG180 dans les poches hydrophobes de SaClpP (f) et HsClpP (g). La carte d'omission fo-fc est profilée à 3,0 Å et colorée en vert, tandis que la carte 2fo-fc est profilée à 1,0 Å et colorée en magenta. ZG180 est représenté en bâton cyan. Les liaisons hydrogène sont indiquées par des lignes pointillées sombres et la distance en Å est étiquetée. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Pour étudier le mécanisme moléculaire de notre protéolyse promue par l'activateur des protéases ClpP, nous avons résolu la structure cristalline de ZG180 lié à SaClpP (7WID dans PDB) et HsClpP (7WH5 dans PDB) à une résolution de 1,90 Å et 2,13 Å, respectivement (Supplémentaire Tableau 1). La structure ZG180 / SaClpP ou ZG180 / HsClpP est un tétradécamère unique composé de deux anneaux heptamériques empilés (Fig. 1d, e). Comme les activateurs ClpP précédemment caractérisés, la liaison de quatorze molécules ZG180 induit un état ouvert dans les cylindres ClpP tétradécamériques avec un pore d'entrée à axe élargi42,43,44,45. Les densités électroniques apparentes dans les cartes d'omission 2fo-fc et fo-fc démontrent sans ambiguïté la liaison de ZG180 sur la surface apicale de SaClpP et HsClpP (Fig. 1f, g). Le motif naphtyle et la chaîne trifluorobutyle dans ZG180 forment un empilement hydrophobe dans les poches de liaison de SaClpP, ce qui contribue aux interactions améliorées. Un réseau de liaisons hydrogène entre ZG180 et les chaînes latérales de D27, L49, Q52, Y61 et Q89 augmente collectivement l'affinité de liaison à SaClpP (Fig. 1f). Une manière de liaison similaire est observée dans la structure ZG180 / HsClpP (Fig. 1g). Ces caractéristiques structurelles sont similaires aux complexes structuraux précédemment rapportés de SaClpP et HsClpP liés à des activateurs de petites molécules, tels que ADEP 4/SaClpP, ADEP-28/HsClpP et ONC201/HsClpP27,28,35, dans lesquels toutes les molécules activatrices sont positionnés de manière similaire dans les poches hydrophobes et empêchent la liaison de l'ATPase au ClpP.

Pour concevoir un activateur spécifique pour SaClpP sur HsClpP, nous avons analysé les séquences d'acides aminés qui peuvent affecter le mode de liaison de ZG180 dans deux protéines ClpP. Alors que SaClpP et HsClpP partagent une grande similitude dans les séquences primaires (Fig. 2a supplémentaire), il existe un grand motif indole de W146 dans HsClpP mais une chaîne latérale isopropylique beaucoup plus petite de I91 dans SaClpP en position conservée. En effet, la superposition structurale des complexes ZG180/SaClpP et ZG180/HsClpP révèle également que le carbone α du motif naphtyle dans ZG180 est susceptible d'être un site discriminant pour introduire un choc stérique contre la chaîne latérale volumineuse de W146 dans HsClpP (Fig. 2a). À cette fin, nous avons incorporé un groupe méthyle sur ZG180 pour obtenir deux analogues de naphtalène-1-ylméthyle (R) - et (S) -ZG197 (Fig. 2b). Semblable à ZG180, (R)-ZG197 et (S)-ZG197 activent SaClpP pour dégrader l'α-caséine et SaFtsZ in vitro (Fig. 2c, Fig. 2b, c supplémentaires). Contrairement à l'activateur non sélectif ZG180, (R)-ZG197 active SaClpP avec une valeur EC50 de 1,5 μM qui est une activité 20 fois plus élevée que celle qui active HsClpP, tandis que (S)-ZG197 ne parvient pas à activer HsClpP même à 100 μM (Fig. 2c et Fig. 2d supplémentaire). De plus, (R)-ZG197 et (S)-ZG197 favorisent la dégradation de la protéine cellulaire SaFtsZ dans les lysats cellulaires de la souche S. aureus 8325-4 clpP knock-out (ΔclpP) avec le supplément de la protéine recombinante SaClpP, mais pas de dégradation de SaFtsZ. s'est produit en présence de la protéine recombinante HsClpP. En revanche, l'activateur global ONC212 active à la fois SaClpP et HsClpP pour dégrader la protéine SaFtsZ cellulaire (Fig. 2d). En conclusion, en utilisant une conception basée sur la structure, nous avons développé avec succès les activateurs SaClpP spécifiques à l'espèce (R) - et (S) -ZG197 qui perturbent le moins possible l'activité du ClpP mitochondrial in vitro.

a Superposition structurelle des complexes ZG180/SaClpP et ZG180/HsClpP pour révéler la stratégie de conception d'activateurs sélectifs pour SaClpP sur HsClpP. SaClpP et HsClpP sont représentés respectivement dans des tubes de dessin animé gris et blé. Le ZG180 est coloré en cyan dans la structure ZG180/SaClpP, alors qu'il est coloré en jaune dans la structure ZG180/HsClpP. I91 dans SaClpP et W146 dans HsClpP sont représentés par un bâton. b Structures des activateurs SaClpP (R) - et (S) -ZG197 développés par la conception basée sur la structure décrite en (a). Le groupe méthyle chiral est indiqué en rouge. c Quantification de l'hydrolyse de l'α-caséine par SaClpP et HsClpP en présence de (R)- et (S)-ZG197, respectivement (n = 3 expériences biologiquement indépendantes). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD (barres d'erreur). d Effet des activateurs sur la dégradation de la protéine SaFtsZ cellulaire avec le supplément d'albumine de sérum bovin (BSA), le SaClpP recombinant et le HsClpP, respectivement, dans les lysats cellulaires du mutant de délétion clpP (ΔclpP). L'abondance de SaFtsZ cellulaire est quantifiée avec un test Western blot. La quantification sur l'intensité de la bande de SaFtsZ est normalisée par rapport au contrôle de charge de SaGAPDH, et le rapport dans le groupe DMSO est considéré comme 1,0. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Pour expliquer pourquoi nos activateurs activent sélectivement SaClpP plutôt que HsClpP in vitro, nous avons mesuré les interactions directes entre les composés (R)- ou (S)-ZG197 et les deux protéases ClpP. Au cours de l'analyse par fluorimétrie différentielle à balayage (DSF), (R) -ZG197 améliore significativement la stabilité thermique de SaClpP de manière dose-dépendante tout en ayant un faible effet sur HsClpP (Fig. 3a). Cela indique que (R)-ZG197 présentait une affinité de liaison plus forte pour SaClpP que HsClpP. De même, (S) -ZG197 augmente la température de fusion (Tm) de SaClpP mais modifie à peine la Tm de HsClpP (Fig. 3b). Nous avons ensuite effectué un test de calorimétrie de titrage isotherme (ITC) pour déterminer les stoechiométries de la capacité de liaison. La constante de dissociation (Kd) pour la liaison de (R) - et (S) -ZG197 à SaClpP est quantitativement estimée à 2, 5 ± 0, 2 μM et 5, 0 ± 0, 3 μM, respectivement (Fig. 3c). Nous avons également analysé la liaison de nos activateurs à SaClpP et HsClpP en interférométrie de biocouche (BLI). De même, (R) - et (S) -ZG197 affichent un Kd de 58 ± 4, 8 nM et 470 ± 60 nM pour la liaison à SaClpP, respectivement (Fig. 3a supplémentaire). Cependant, ni (R)-ZG197 ni (S)-ZG197 ne présentent d'affinité de liaison détectable avec HsClpP dans l'analyse BLI (Fig. 3b supplémentaire). Cela indique que nos activateurs se lient sélectivement à SaClpP plutôt qu'à HsClpP in vitro.

Effet de (R)-(a) et (S)-ZG197 (b) sur la stabilité thermique de SaClpP et HsClpP dans le test DSF, respectivement. Tm, température de fusion. c Détermination de la liaison de (R)- et (S)-ZG197 à SaClpP par titrage ITC. La constante de dissociation (Kd) et le facteur de stoechiométrie (N) sont indiqués. Effet des activateurs sur la stabilité thermique des cellules SaClpP (d) et HsClpP (e), respectivement. Le S. aureus 8325-4 a été cultivé en présence de 10 μM de composé pendant 2 h avant d'exécuter le CETSA (d), tandis que les lysats cellulaires de HEK 293 T/17 ont été dosés au CETSA (e). Les protéines des échantillons non chauffés sont utilisées comme intrants et considérées comme 100 %. Les données (a, b, d et e) sont obtenues à partir de trois expériences biologiquement indépendantes et présentées sous forme de moyenne ± SD (barres d'erreur). Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Nous avons ensuite étudié si nos activateurs interagissent directement avec le SaClpP dans les cellules staphylococciques en effectuant le test de décalage thermique cellulaire (CETSA). Nous avons observé une stabilité thermique significativement accrue de SaClpP lorsque la souche S. aureus 8325-4 a été cultivée avec 10 μM (R) - ou (S) -ZG197 (Fig. 3d et Fig. 3c supplémentaire). Une élévation similaire de SaClpP Tm s'est produite lorsque des cellules bactériennes ont été traitées avec ONC212. Cela indique que nos activateurs sélectifs et l'activateur global ONC212 peuvent se lier directement à la protéase SaClpP dans les cellules staphylococciques. Nous avons également effectué CETSA dans la lignée cellulaire HEK 293T/17 pour tester si nos activateurs se lient à HsClpP. Semblable au DMSO, (R) - et (S) -ZG197 ont des effets minimes sur la stabilité thermique de HsClpP dans les cellules HEK 293 T / 17, tandis que ONC212 a considérablement augmenté la stabilité de HsClpP (Fig. 3e et Fig. 3d supplémentaire). Par conséquent, les résultats du test de liaison cellulaire mettent en évidence des interactions directes et sélectives de nos activateurs envers SaClpP mais pas HsClpP dans des contextes cellulaires, ce qui est similaire aux résultats des tests de liaison biophysique in vitro.

Pour révéler les informations structurelles sur le mécanisme d'activation sélective de (R)- et (S)-ZG197' sur la protéolyse SaClpP, nous avons déterminé les structures cristallines aux rayons X de (R)-ZG197/SaClpP (7XBZ dans PDB) et (S )-ZG197/SaClpP (7WGS dans PDB) complexes à une résolution de 2,15 Å et 2,11 Å, respectivement (tableau supplémentaire 1). Les structures résolues démontrent que douze (R) -ZG197 ou quatorze (S) -ZG197 activateurs se lient dans les quatorze poches hydrophobes de SaClpP (Fig. 4a supplémentaire), et les cartes de densité électronique montrent distinctement l'existence de (R)- et ( S)-ZG197, respectivement (Fig. 4a, b). Les motifs naphtyle de (R)- et (S)-ZG197 pointent dans des directions différentes en raison des substituants méthyle chiraux. Le groupe carbonyle dans (R)- et (S)-ZG197 forme une liaison hydrogène avec H83 de SaClpP, et la chaîne latérale de Q52 forme également une liaison hydrogène avec (R)-ZG197 directement ou (S)-ZG197 médiée par une molécule d'eau. Des liaisons hydrogène supplémentaires médiées par les chaînes latérales de D27, L49 contribuent conjointement à la liaison de (S) -ZG197 à SaClpP (Fig. 4a, b). De plus, des interactions hydrophobes étendues sont observées sur (R) - et (S) -ZG197 dans les sites de liaison du ligand de SaClpP (Fig. 4b supplémentaire). L'alignement structurel de SaClpP (6TTY dans PDB), ADEP 4/SaClpP (6TTZ dans PDB), (R)-ZG197/SaClpP (7XBZ dans PDB) et (S)-ZG197/SaClpP (7WGS dans PDB) donne une moyenne racine Cα faible des valeurs d'écart carré (RMSD) d'environ 0, 2 Å pour le monomère ClpP, indiquant une forte similitude du repliement de ClpP (Fig. 4c supplémentaire) 43, 46, 47. Comme l'activateur global ADEP 4, les liaisons (R)- et (S)-ZG197 induisent un état étendu de SaClpP, qui a été caractérisé par une orientation droite de l'hélice α526. De plus, la triade catalytique (S98, H123 et D172) est également affichée dans des orientations très similaires dans ces structures (Fig. 4d supplémentaire). Fait intéressant, seules quatre ou cinq des quatorze boucles N-terminales sont ordonnées dans les complexes structuraux de (R)- et (S)-ZG197/SaClpP, ce qui implique la nature hautement dynamique de ces motifs lors de la liaison des activateurs.

Vue rapprochée des interactions de (R)-(a) et (S)-ZG197 (b) dans le site hydrophobe de SaClpP. La carte d'omission fo-fc pour montrer la liaison (R)- et (S)-ZG197 est profilée à 3,0 Å et colorée en vert, tandis que la carte 2fo-fc est profilée à 1,0 Å et colorée en magenta, respectivement. (R)- et (S)-ZG197 sont colorés en rose clair et bleu clair, respectivement. Les liaisons hydrogène sont indiquées par des lignes pointillées sombres et la distance est indiquée en Å. c Vue rapprochée des alignements structurels de (R)- et (S)-ZG197 liés aux complexes SaClpP et ZG180 liés à HsClpP dans les poches hydrophobes. ZG180, (R)- et (S)-ZG197 sont colorés respectivement en cyan, rose clair et bleu clair. SaClpP est coloré en gris, tandis que HsClpP est coloré en blé. d Quantification de l'hydrolyse de la caséine α par le mutant SaClpPI91W en présence de (R)-ZG197, (S)-ZG197 et ONC212, respectivement. e Effet des activateurs sur la stabilité thermique de la protéine SaClpPI91W détectée dans le test DSF. f Images Western blot représentatives montrant les effets d'activateurs 10 μM sur la dénaturation thermique de la protéine SaClpPI91W dans des cellules intactes de la souche mutante clpPI91W complémentée. L'expression de SaClpPI91W a été induite en présence de tétracycline anhydre (ATC) à 1 ng/mL. Trois répétitions biologiques ont été réalisées pour chaque expérience. g Quantification de l'hydrolyse de l'α-caséine favorisée par les activateurs ClpP par le mutant HsClpPW146A. h Effet des activateurs sur la stabilité thermique du mutant HsClpPW146A détecté dans le test DSF. i Une vue rapprochée de l'alignement structurel en (c) montre l'effet des résidus C-terminaux sur la liaison des activateurs et l'activation de HsClpP. j Quantification de l'effet de l'hydrolyse de l'α-caséine activée par les activateurs par les troncatures HsClpPΔC (à gauche) et HsClpPW146AΔC (à droite), respectivement. k Effet des activateurs sur la stabilité thermique de HsClpPΔC (gauche) et HsClpPW146AΔC (droite) détectés dans le test DSF Les données (d, e, g, h, j et k) sont obtenues à partir de trois expériences biologiquement indépendantes et présentées sous forme de moyenne ± SD (barres d'erreur). Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Pour comprendre le mécanisme structurel qui fait que (R)- et (S)-ZG197 se lient et activent sélectivement SaClpP mais pas HsClpP, nous avons aligné nos structures résolues de (R)-ZG197/SaClpP et (S)-ZG197/SaClpP sur la structure ZG180/HsClpP. Le groupe naphtyle dans (S)-ZG197 est positionné dans la direction opposée par rapport à celui dans ZG180 et (R)-ZG197, ce qui entraîne un conflit direct avec la chaîne latérale de W146 dans HsClpP. Cela peut empêcher (S) -ZG197 de se lier à HsClpP dans un mode similaire à SaClpP (Fig. 4c). Bien que le groupe naphtyle dans (R) -ZG197 soit éloigné de la chaîne latérale de W146 dans HsClpP, le substituant méthyle dans (R)-ZG197 peut générer un encombrement spatial et entrer en conflit avec W146 dans HsClpP, ce qui explique probablement pourquoi (R )-ZG197 ne peut pas interagir avec HsClpP. L'analyse de l'alignement structurel suggère que I91 dans SaClpP et W146 dans HsClpP sont principalement des sites critiques responsables de la liaison sélective et de l'activation de nos activateurs sur SaClpP mais pas sur HsClpP.

Pour illustrer comment I91 influence la liaison de nos activateurs à SaClpP, nous avons construit un mutant I91W dans SaClpP pour imiter le W146 correspondant dans HsClpP et déterminé si (R)- et (S)-ZG197 se lient et activent le mutant SaClpPI91W. Comme prévu, (S) -ZG197 présente une activité considérablement réduite sur le mutant SaClpPI91W pour l'hydrolyse de la caséine α, tandis que (R) -ZG197 et ONC212 activent toujours SaClpPI91W pour dégrader la caséine α in vitro (Fig. 4d et Fig. 4e supplémentaire ). Nous avons ensuite étudié les interactions entre les activateurs ClpP et le mutant SaClpPI91W dans DSF. Conformément à l'observation biochimique, (S) -ZG197 ne peut pas stabiliser thermiquement le mutant SaClpPI91W, tandis que (R) -ZG197 et ONC212 augmentent toujours de manière significative la Tm du mutant SaClpPI91W (Fig. 4e). Nous avons ensuite déterminé quantitativement l'affinité de (R) -ZG197 pour la liaison à SaClpPI91W, et le Kd est de 0, 93 ± 0, 2 μM dans le test ITC. Aucune liaison n'a été observée entre (S) -ZG197 et SaClpPI91W (Fig. 4f supplémentaire). Il convient de noter que (R)-ZG197 est toujours positif sur le mutant SaClpPI91W. Cela est dû au substituant méthyle dans (R) -ZG197 qui peut contribuer à l'affinité hydrophobe avec W91 dans le mutant SaClpPI91W, alors qu'il se heurte probablement à W146 dans HsClpP (Fig. 4c). Une structure résolue du complexe (R)-ZG197/SaClpPI91W serait bénéfique pour révéler le mécanisme de ce phénomène. De plus, nous avons construit la souche mutante clpPI91W complémentée via un vecteur d'expression inductible par la tétracycline pYJ335 dans le mutant ΔclpP (Fig. 4g supplémentaire) et évalué les interactions cellulaires entre les activateurs et le mutant SaClpPI91W dans la souche complémentée. Conformément aux interactions observées in vitro, le traitement (S)-ZG197 ne parvient pas à induire le déplacement de Tm de SaClpPI91W dans les cellules staphylococciques intactes, tandis que (R)-ZG197 et l'activateur global ONC212 présentent des effets importants sur la stabilisation de SaClpPI91W (Fig. 4f et Fig. 4h supplémentaire).

Nous avons également construit le mutant HsClpPW146A pour tester si le conflit stérique proposé entre nos activateurs et la chaîne latérale rigide de W146 limite leur liaison à HsClpP. Contrairement à l'observation selon laquelle (R) -ZG197 est inactif sur HsClpP, (R) -ZG197 devient actif pour promouvoir le mutant HsClpPW146A pour l'hydrolyse de la caséine α (Fig. 4g et Fig. 4i supplémentaire) et affiche une affinité de liaison envers HsClpPW146A tel que mesuré dans le test DSF (Fig. 4h). ONC212 se lie toujours et active à la fois HsClpP et le mutant W146A in vitro. Cependant, étant donné que (S)-ZG197 ne parvient pas à se lier à HsClpPW146A et à l'activer, nous avons émis l'hypothèse que d'autres facteurs structurels atténuent l'interaction de (S)-ZG197 et du mutant HsClpP. Auparavant, il a été suggéré que le motif supplémentaire dans l'extrémité C-terminale de HsClpP perturbe la liaison du chaperon ClpX48. En particulier, nous avons remarqué que les résidus P248 et P249 pourraient former un motif de couvercle qui pourrait entraver l'approche et la liaison des activateurs aux sites hydrophobes de HsClpP (Fig. 4i). Ce motif de couvercle supplémentaire dans HsClpP est également conservé dans d'autres ClpP eucaryotes, comme Mus Musculus ClpP (MoClpP) et Danio Rerio ClpP (DaClpP). Cependant, cette séquence C-terminale est raccourcie et le motif de couvercle correspondant est absent dans les ClpP bactériens, tels que SaClpP et Escherichia coli ClpP (EcClpP) (Fig. 2a supplémentaire).

Nous avons ensuite purifié les protéines HsClpP (HsClpPΔC) et HsClpPW146A (HsClpPW146AΔC) tronquées C-terminales et détecté les effets de nos activateurs sur les deux troncatures. Semblable aux faibles effets sur HsClpPW146A, (S) -ZG197 active encore très peu et stabilise à peine HsClpPΔC in vitro (Fig. 4j et k et Fig. 4j supplémentaire). Cependant, (S) -ZG197 devient actif pour promouvoir le mutant HsClpPW146AΔC pour l'hydrolyse de la caséine α et affiche une affinité de liaison telle que mesurée dans DSF (Fig. 4j et k et Fig. 4k supplémentaire), indiquant l'action conjointe de W146 et du motif C-terminal dans HsClpP. Fait intéressant, (R) -ZG197 et ONC212 présentent des capacités améliorées de liaison et d'activation sur HsClpPW146AΔC par rapport à HsClpPW146A et HsClpPΔC (Fig. 4j et k et Fig. 4k supplémentaire). Au total, cela indique que les deux acides aminés distincts (I91 dans SaClpP et W146 dans HsClpP) dans les poches hydrophobes et le motif de couvercle C-terminal supplémentaire dans HsClpP sont des facteurs cruciaux qui peuvent déterminer l'activation sélective de SaClpP sur HsClpP par notre espèce. activateurs spécifiques.

Nous avons ensuite effectué un test de concentration minimale inhibitrice (CMI) en culture liquide pour déterminer les effets antibactériens de nos activateurs sur la souche S. aureus 8325-4. (R)-ZG197 supprime de manière significative S. aureus avec une CMI quantifiée de 0,5 μg/mL, qui est aussi actif que ONC212 (Fig. 5a). (S)-ZG197 inhibe également la croissance de S. aureus 8325-4, et la CMI est de 4 μg/mL. Le (R)-ZG197 et le (S)-ZG197 présentent tous deux de bien meilleurs effets inhibiteurs sur la croissance des staphylocoques que le composé à succès ICG-001. Pour disséquer si l'activité antistaphylococcique de nos activateurs dépend de ClpP chez S. aureus, nous avons déterminé les effets inhibiteurs de nos activateurs sur le mutant ΔclpP et les souches mutantes clpP ou clpPI91W complémentées, respectivement (Fig. 5a). Les activateurs sélectifs (R)- et (S)-ZG197 ou les activateurs globaux ICG-001 et ONC212 suppriment au minimum la croissance de la souche mutante ΔclpP, et on observe que tous les MIC sont supérieurs à 256 μg/mL. Le phénotype antibactérien peut être sauvé dans la souche clpP complémentée en présence d'activateurs ClpP. Contrairement à (R)-ZG197 et ICG-001 et ONC212, l'activité antibactérienne de (S)-ZG197 est significativement atténuée dans la souche mutante clpPI91W complémentée puisque (S)-ZG197 est inactif sur le mutant SaClpPI91W in vitro et dans les cellules. Cela indique que nos activateurs ont présenté des activités antibactériennes de manière dépendante de SaClpP chez S. aureus.

a Évaluation des activateurs ClpP sur la croissance de S. aureus 8325-4 avec des antécédents génétiques de clpP, ΔclpP et clpP complémenté ou mutant I91W par mesure de la CMI. b Évaluation de l'effet des activateurs de SaClpP sur l'abondance cellulaire de SaFtsZ dans les cellules intactes de 8325-4, ΔclpP, les souches clpP complémentées et clpPI91W détectées en Western blot. La quantification sur l'intensité de la bande de SaFtsZ est normalisée par rapport au contrôle de charge de SaGAPDH, et le rapport dans le groupe DMSO est considéré comme 1,0. c Vues représentatives de micrographies SEM montrant les effets de (R)- et (S)-ZG197 sur la morphologie cellulaire de S. aureus 8325-4 ayant différents antécédents génétiques de clpP, ΔclpP et clpP ou clpPI91W complétés. La barre d'échelle représente 1 µm. d Vues représentatives de micrographies SEM montrant l'effet de 20 µM (R)- et (S)-ZG197 sur la division cellulaire des souches Newman et USA300. La barre d'échelle représente 1 µm. e Détermination de la CMI des activateurs SaClpP contre la croissance d'un panel de souches de S. aureus. (R)- et (S)-ZG197, ONC212 et les antibiotiques cliniques oxacilline, tétracycline, érythromycine, norfloxacine, clindamycine et gentamicine ont été dosés dans des conditions similaires. Les expériences ont été réalisées en triple. f Effet bactéricide de la thérapie combinée (R)- et (S)-ZG197 sur l'éradication de la phase stationnaire USA300 (n = 3 expériences biologiquement indépendantes). Le nombre de cellules a été enregistré en UFC/mL. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

La protéine de division cellulaire SaFtsZ pourrait être sur-dégradée lors de l'activation aberrante de SaClpP en présence d'activateurs dans les cellules25. En effet, tous les activateurs, y compris (R)-ZG197, (S)-ZG197 et ONC212, diminuent l'abondance de SaFtsZ dans le 8325-4 S. aureus mais pas dans la souche mutante ΔclpP correspondante, comme détecté par le test d'immunotransfert (Fig. 5b). Les abondances de SaFtsZ sont considérablement diminuées dans le mutant clpP ou clpPI91W complémenté en présence de l'activateur sélectif (R)-ZG197 ou de l'activateur global ONC212. Semblable à l'observation que (S)-ZG197 ne pouvait pas activer l'activité de la protéase mutante SaClpPI91W, nous n'avons observé aucune diminution évidente de l'abondance de SaFtsZ dans la souche clpPI91W complémentée en présence de (S)-ZG197. Cela indique que nos activateurs ont induit la dégradation aberrante de SaFtsZ chez S. aureus, qui dépend fortement du SaClpP cellulaire.

La dégradation dérégulée de SaFtsZ pourrait altérer la division cellulaire chez S. aureus24,25. Nous avons ensuite mesuré la morphologie cellulaire des cellules staphylococciques à l'aide d'un microscope électronique à balayage (MEB), ce qui pourrait refléter les effets inhibiteurs de nos activateurs sur la division cellulaire staphylococcique49. Les diamètres des cellules staphylococciques sont mesurés à 0,64 μm, 0,69 μm, 0,73 μm et 0,75 μm en moyenne pour les souches 8325-4, ΔclpP et clpP ou clpPI91W complémentées dans les groupes de véhicules, respectivement (Fig. 5c et Fig. 5a supplémentaire). . Fait intéressant, similaire aux effets inhibiteurs de l'inhibiteur de FtsZ TXA709 sur la division cellulaire staphylococcique, les traitements (R)- et (S)-ZG197 agrandissent considérablement les diamètres cellulaires de 8325-4 et des souches clpP complémentées, les diamètres mesurés étant généralement supérieurs à 1,00 µm50. Le rétrécissement, la lyse et la dégradation complète de la morphologie des cellules staphylococciques ont été observés chez les bactéries traitées avec nos activateurs. En revanche, nous n'avons pas observé de changements dans le diamètre bactérien ou la morphologie cellulaire lorsque le mutant ΔclpP a été exposé aux activateurs (R) - et (S) -ZG197. Le traitement avec (R)-ZG197 entraîne une augmentation de la taille des cellules dans la souche mutante clpPI91W complémentée, tandis que (S)-ZG197 n'a aucun effet sur le diamètre bactérien dans cette souche. Nous avons également testé l'effet de nos activateurs sélectifs sur les divisions cellulaires chez Newman, un isolat clinique de souche S. aureus sensible à la méthicilline, et dans USA300, un isolat représentatif de SARM (tableau supplémentaire 2). Un phénomène similaire d'agrandissement des diamètres dans les cellules Newman et USA300 a été observé en présence de (R) - et (S) -ZG197 (Fig. 5d, Fig. 5b, c supplémentaires). Nous avons démontré que (R)- et (S)-ZG197 présentent des effets suppresseurs sur la division cellulaire chez S. aureus, qui dépend du SaClpP cellulaire.

Étant donné que nos activateurs spécifiques à l'espèce suppriment la croissance de S. aureus 8325-4, nous avons ensuite testé le spectre antistaphylococcique de (R)- et (S)-ZG197 contre un panel de souches de S. aureus, y compris la souche Newman et multidrug- souches de SARM résistantes. Les souches de SARM USA300, NRS-1, NRS-70, NRS-100, NRS-108 et NRS-271 ont été collectées auprès du Network on Antimicrobial Resistance in S. aureus (tableau supplémentaire 2). (R)-ZG197 affiche une forte activité antibactérienne sur un large spectre de ces souches de S. aureus, avec des valeurs de CMI de 0,5-2 μg/mL, tandis que (S)-ZG197 supprime la croissance de ces souches avec des valeurs de CMI modérées de 2– 8 μg/mL (Fig. 5e, panneau de gauche). Nous avons également testé les effets antibactériens de nos activateurs sur cinq isolats de SARM multirésistants acquis en milieu hospitalier en Chine, notamment XJ009, XJ036, XJ049, XJ051 et XJ052 (tableau supplémentaire 2). Ces isolats cliniques de SARM ont développé une résistance remarquable à plusieurs antibiotiques cliniques, notamment l'oxacilline, la tétracycline, l'érythromycine, la norfloxacine, la clindamycine et la gentamicine, mais ils sont tous sensibles à nos activateurs avec des valeurs de CMI de 0,5 à 1 μg/mL pour (R)- ZG197 et 2–8 μg/mL pour (S)-ZG197, respectivement (Fig. 5e, panneau de droite). L'activateur global ONC212 présente également de faibles valeurs de CMI sur ces souches.

Semblables à ONC212 et à la vancomycine, (R) -ZG197 et (S) -ZG197 présentent d'excellents effets bactéricides sur la souche Newman à croissance exponentielle (Fig. 5d supplémentaire). Nous avons ensuite évalué les effets antibactériens de nos activateurs sur l'éradication des persistants, qui sont des cellules soumises à un stress aigu pour susciter la persistance des antibiotiques51. Une cohorte de cellules de S. aureus en phase stationnaire pendant la nuit qui souffraient d'une limitation en nutriments persiste et a été difficile à éradiquer avec des antibiotiques conventionnels52. Comme les ADEP bien établis de l'activateur ClpP, (R)-ZG197, (S)-ZG197, la rifampicine et la ciprofloxacine réduisent chacune de manière minimale les unités formant colonies (UFC) de la souche SARM des cultures USA300 (Fig. 5f et Supplément Fig. 5e), tandis qu'une thérapie combinée utilisant soit (R)-ZG197 ou (S)-ZG197 avec de la rifampicine ou de la ciprofloxacine réduit de manière significative le nombre de USA300 persistants à la limite de détection (Fig. 5f). Pour étudier plus avant l'effet suppresseur de la thérapie combinée sur les cellules persistantes de S. aureus, nous avons effectué un test de destruction biphasique sur la souche USA300. Semblable à l'ADEP 423, nous avons constaté que l'ajout d'un deuxième antibiotique conventionnel, tel que la rifampicine ou la ciprofloxacine, altère légèrement la croissance des persistants induits par la ciprofloxacine, tandis que la présence d'activateurs (R)- et (S)-ZG197 SaClpP éradique complètement les persistants à la limite de détection (Fig. 5f supplémentaire). Ensemble, ces résultats confirment que nos activateurs éradiquent les staphylocoques persistants aussi efficacement que l'ADEP 4 lorsqu'ils sont combinés avec des antibiotiques conventionnels.

Nous avons également criblé les mutants résistants de SaClpP induits par nos activateurs spécifiques à l'espèce. Les taux de résistance sont définis selon le protocole établi47. Les fréquences de résistance spontanée induite par 4 × MIC de (R)-ZG197 et (S)-ZG197 sont de l'ordre de 10−7, qui sont comparables à ADEP 4 et ONC212, les activateurs globaux de ClpP. Tous les sites de mutation sont distribués au hasard et situés à l'extérieur des poches de liaison hydrophobes de ClpP (tableau supplémentaire 3).

Pour tester les effets anti-infectieux de nos activateurs in vivo, nous avons d'abord évalué leurs profils bioactifs. Contrairement au composé de dépistage ICG-001 qui a été initialement identifié comme un inhibiteur de Wnt/β-caténine, (R)- et (S)-ZG197 perturbent de manière minimale la voie de signalisation Wnt/β-caténine dans HEK 293T/17 et HK-2 lignées cellulaires dans le test de rapporteur Wnt / β-caténine luciférase (Fig. 6a supplémentaire) 39. Nous avons ensuite étudié les effets de nos activateurs SaClpP sur la viabilité des lignées cellulaires HEK 293T/17 et HK-2 dans le test MTT. Comme prévu, (R) - et (S) -ZG197 ont des effets toxiques minimes sur la prolifération des cellules de mammifères, comme en témoignent de faibles activités inhibitrices avec des valeurs IC50 élevées (Fig. 6b supplémentaire). En revanche, l'activateur global ONC212 et notre composé à succès ICG-001 inhibent considérablement la viabilité des cellules de mammifères, en particulier ONC212, qui a de faibles valeurs IC50 de 20 à 60 nM. Nous avons également évalué l'effet cytotoxique de nos activateurs sur le poisson zèbre. L'administration de (R)- ou (S)-ZG197 à une dose unique de 25 ou 50 mg/kg n'a aucun effet cytotoxique sur la survie du poisson zèbre (Fig. 6c supplémentaire). Lorsqu'il est administré à 100 mg / kg, ONC212 provoque de manière significative la mort du poisson zèbre, tandis que (R) - ou (S) -ZG197 est toujours sans danger pour le poisson zèbre (Fig. 6c supplémentaire). Cela indique la biosécurité de nos activateurs spécifiques à l'espèce pour les infections antistaphylococciques in vivo.

Nous avons ensuite évalué les effets antibactériens in vivo du ZG197 à l'aide d'un modèle d'infection du poisson zèbre, qui est un modèle in vivo largement utilisé pour évaluer les agents antistaphylococciques contre les infections à S. aureus53. Nous avons d'abord déterminé une UFC appropriée de S. aureus pouvant entraîner la mortalité du poisson zèbre dans un délai raisonnable (Fig. 6d supplémentaire). Nous avons évalué le pouvoir antibactérien de nos activateurs SaClpP en mesurant le taux de survie du poisson zèbre après une infection staphylococcique pendant cinq jours (Fig. 6e supplémentaire). Une administration unique de 50 mg / kg de (R) - et (S) -ZG197 prolonge de manière significative le taux de survie du poisson zèbre infecté par USA300 (Fig. 6a). Une dose plus faible de (R) - ou (S) -ZG197 à 25 mg / kg protège également efficacement le poisson zèbre contre l'infection mortelle induite par USA300 (Fig. 6f supplémentaire). De même, l'administration de 25 mg/kg ou 50 mg/kg (R)-ZG197 améliore efficacement le taux de survie du poisson zèbre infecté par Newman, qui a un meilleur taux de survie que ONC212 (Fig. 6g et Fig. 6b supplémentaires). Cependant, (R) -ZG197 perd ses effets thérapeutiques sur le poisson zèbre infecté par la souche mutante ΔclpP, tandis que la vancomycine est toujours active contre cette infection (Fig. 6c). Cela indique que l'effet antistaphylococcique prometteur de (R)-ZG197 sur le poisson zèbre infecté dépend de SaClpP in vivo. Une administration unique de 50 mg/kg de (R)-ZG197 produit un effet thérapeutique significatif sur le poisson zèbre infecté par la souche clinique de SARM XJ049. En revanche, cette souche est résistante au traitement des antibiotiques utilisés en clinique, l'oxacilline et l'érythromycine (Fig. 6d). Il n'est pas surprenant que l'activateur global ONC212 à 50 mg / kg ne parvienne pas à prolonger le taux de survie des poissons zèbres infectés par le SARM XJ049, probablement en raison de ses effets secondaires cytotoxiques en ciblant DaClpP (Fig. 6d).

a Effet thérapeutique de (R)- et (S)-ZG197 contre l'infection USA300 chez le poisson zèbre. Des poissons zèbres (n = 11 animaux) ont été infectés avec 7 × 106 UFC de USA300 et les composés ont été administrés à une dose unique de 50 mg/kg. Le DMSO (5 %) et la vancomycine ont été administrés comme témoins. Effet thérapeutique de (R)-ZG197 contre l'infection létale par Newman (b) et le mutant ΔclpP (c). Des poissons zèbres (n = 11 animaux) ont été infectés avec 7 × 107 UFC de Newman (b) ou 3 × 107 UFC du mutant ΔclpP (c), et des composés ont été administrés à des poissons zèbres infectés à 50 mg/kg. La vancomycine et ONC212 ont été utilisés comme témoins. d Effet thérapeutique du (R)-ZG197 sur les isolats cliniques de SARM infectés par le poisson zèbre. Des poissons zèbres (n = 11 animaux) ont été infectés avec 5 × 107 UFC de XJ049 et les composés ont été administrés à une dose unique de 50 mg/kg. Le DMSO (5%), les antibiotiques (vancomycine, érythromycine et oxacilline) et l'activateur global ONC212 ont été utilisés comme témoins. e Quantification de la taille de la lésion cutanée nécrotique initiale (panneau de gauche) et 4 jours après l'infection (panneau de droite). La vancomycine a été utilisée comme témoin positif. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD (n = 9 animaux). f Images représentatives montrant des lésions cutanées nécrotiques 4 jours après l'infection. La barre d'échelle représente 1 cm. g Effets de nos activateurs sur le nombre de bactéries dans les échantillons de peau (n = 8 échantillons biologiquement indépendants). Le tissu cutané a été excisé de souris infectées par USA300 4 jours après l'infection et étalé sur TSA pour dénombrer les UFC. h Micrographies de tissus cutanés colorés par H&E après les traitements indiqués. La barre d'échelle représente 1 mm (haut) et 0,1 mm (bas). Les différences statistiques ont été analysées à l'aide de tests Log-Rank (a–d) et de tests t de Student non appariés bilatéraux (e, g). Les valeurs P exactes sont fournies. ns, aucune signification. Les données (e, g) sont présentées sous forme de moyenne ± SD (barres d'erreur). Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Enfin, nous avons évalué l'efficacité anti-infectieuse in vivo de nos activateurs dans des modèles d'infection cutanée murine à S. aureus54. La peau des souris a été inoculée avec 2,5 × 106 UFC de USA300 et une lésion est apparue après 16 h. Les zones de lésion initiales dans chaque groupe sont comparables (Fig. 6e). L'injection sous-cutanée de (R) - et (S) -ZG197 à 7, 5 mg / kg deux fois par jour provoque une taille de lésion nécrotique plus petite chez la souris par rapport au véhicule témoin (Figs. 6e, f). De plus, nous avons observé une réduction significative de la charge bactérienne lorsque nous avons excisé les lésions des souris traitées avec (R) - et (S) -ZG197 par rapport au témoin véhicule (Fig. 6g). L'analyse histologique utilisant la coloration à l'hématoxyline et à l'éosine (H&E) montre également une diminution de la zone nécrotique et des infiltrats inflammatoires dans les tissus cutanés lorsqu'ils sont traités avec nos activateurs ou la vancomycine, tandis que l'échantillon traité avec le véhicule présente des infiltrats inflammatoires denses (Fig. 6h). Collectivement, nous identifions nos activateurs comme des antibiotiques prometteurs contre les infections à SARM multirésistantes in vivo mais avec des effets cytotoxiques minimes.

L'activation aberrante de la protéase bactérienne ClpP est une méthode prometteuse de traitement des infections nosocomiales par des bactéries Gram-positives résistantes aux antibiotiques. L'activateur SaClpP souhaité doit de préférence cibler la ClpP staphylococcique plutôt que de perturber le bon fonctionnement de la ClpP hôte. Cependant, des travaux antérieurs ont identifié plusieurs activateurs mondiaux pour les protéases ClpP de plusieurs espèces, y compris les analogues ADEP et ONC212, qui produiraient inévitablement des effets hors cible involontaires et entraveraient l'application dans la découverte de médicaments pour l'infection anti-MRSA. Par conséquent, l'identification d'échafaudages chimiques distincts qui activent sélectivement SaClpP mettra en évidence son potentiel thérapeutique anti-infectieux pour les infections à SARM en utilisant une stratégie de chimioactivation.

Nous utilisons HTS pour les composés qui favorisent l'activité de la protéase ClpP et la validation expérimentale pour identifier le composé peptidomimétique N-benzyl- et naphtalén-1-ylméthyl-disubstitué (ICG-001) en tant qu'activateur avec une activité modérée pour SaClpP et HsClpP. L'optimisation synthétique des analogues de l'ICG-001 a conduit à la découverte du (6S,9aS)-6-((S)-sec-butyl)-8-(naphtalène-1-ylméthyl)-4,7-dioxo-N-(4, 4,4-trifluorobutyl)hexahydro-2H-pyrazino[1,2-a]pyrimidine-1(6H)-carboxamide (ZG180) avec des activités significativement améliorées sur les deux protéases. L'incorporation d'un groupe substituant méthyle sur ZG180 fait de (R)- et (S)-ZG197 les activateurs les plus puissants et les plus sélectifs pour SaClpP par rapport à HsClpP. Nos activateurs augmentent la dégradation aberrante de la protéine SaFtsZ dans les cellules, inhibent la division des cellules staphylococciques et présentent une efficacité antibiotique significative dans la prévention de l'issue mortelle de la bactériémie à S. aureus in vivo. Des travaux antérieurs ont démontré que l'ICG-001 était un inhibiteur de la voie de signalisation Wnt/β-caténine et exerçait des effets antiprolifératifs dans des modèles murins xénogreffés. Néanmoins, nos activateurs inhibent de manière minimale la viabilité des lignées cellulaires de mammifères, ce qui devrait être exploré plus avant lors du développement clinique des antibiotiques.

Notre identification de (R)- et (S)-ZG197 en tant qu'activateurs spécifiques à l'espèce pour SaClpP fournit des informations structurelles sur le développement de la liaison sélective et de la chimioactivation spécifique de certains ClpP. Le W146 volumineux de HsClpP offre un conflit stérique défavorable avec le substituant naphtyle gênant dans l'activateur (S) -ZG197, empêche donc la liaison des ligands à HsClpP. Cela indique que le résidu W146/I91 est un facteur critique qui détermine en partie la sélectivité des espèces de nos activateurs. En plus de l'observation que W146 dans HsClpP représente un point critique pour la discrimination de l'activateur, notre travail révèle également l'action conjointe de W146 avec le motif C-terminal dans HsClpP, comme en témoignent les activités récupérées de (S)-ZG197 et les activités améliorées de (R)-ZG197 vis-à-vis de la liaison et de l'activation de HsClpPW146AΔC par rapport au mutant HsClpPW146A ou à la troncature HsClpPΔC. Parallèlement aux recherches publiées précédemment, cela montre que les facteurs structurels clés, y compris la différence spatiale dans les poches hydrophobes et la coordination d'autres acides aminés, contribuent de manière significative à la discrimination des activateurs ClpP. De plus, les activateurs variants répondent différemment aux protéines ClpP bactériennes et mitochondriales.

La chimioactivation du ClpP bactérien le fait basculer efficacement dans un état incontrôlable pour déclencher une dégradation excessive de nombreux substrats cruciaux pour les bactéries et finalement détruire les bactéries pathogènes. Nous démontrons que (R)-ZG197 et (S)-ZG197 se lient sélectivement à SaClpP sur HsClpP, induisent le SaClpP lié à l'activateur dans la conformation active entièrement étendue pour l'hydrolyse non sélective de protéines essentielles, telles que FtsZ. Bien que la ClpP bactérienne ne soit pas essentielle à la survie, les activateurs ClpP sont enclins à induire une mutation ClpP et donc à développer une résistance. Par conséquent, la thérapie combinée est probablement la meilleure méthode d'application thérapeutique pour les activateurs SaClpP, ce qui pourrait réduire la résistance basée sur la cible, élargir le spectre antibiotique et réduire la posologie et les effets secondaires indésirables. Nous montrons également que (R)-ZG197 ou (S)-ZG197 utilisé en combinaison avec la rifampicine ou la ciprofloxacine éradique considérablement la population de persistants au niveau de détection.

Étant donné les protéases ClpP hautement conservées parmi plusieurs espèces, il faut déterminer si nos activateurs peuvent de la même manière faire basculer d'autres protéases ClpP de différentes espèces dans des états de gain de fonction, en particulier avec les bactéries Gram-négatives et le microbiote intestinal. D'autres optimisations synthétiques sont nécessaires pour améliorer les capacités antimicrobiennes de nos activateurs SaClpP spécifiques à l'espèce pour traiter les infections à SARM. L'évaluation des effets anti-infectieux de nos activateurs sur d'autres modèles infectieux animaux in vivo caractériserait pleinement la puissance antibactérienne de ces activateurs.

En conclusion, nous rapportons (R)- et (S)-ZG197 comme activateurs sélectifs de SaClpP et identifions les résidus/motifs critiques pour la promotion sélective de SaClpP plutôt que de HsClpP. Nos données fournissent des informations mécanistes sur la chimioactivation des protéases ClpP et accélèrent la découverte de médicaments antibiotiques spécifiques à l'espèce qui peuvent perturber sélectivement la fonction de la protéase staphylococcique. Ce travail a le potentiel d'inspirer des stratégies prometteuses pour le traitement des infections à SARM et contribue à la génération de puissants échafaudages antibiotiques synthétiques avec une cytotoxicité minimale pour l'hôte.

Des poissons zèbres de type sauvage (âgés de 7 à 11 mois, 300 ± 50 mg, quel que soit leur sexe) ont été achetés à l'aquarium de Xiaoguan (Shanghai, Chine) et maintenus dans un réservoir de 10 L à température ambiante avec une alimentation régulière. Une taille similaire et une distribution aléatoire par sexe du poisson zèbre ont été utilisées pour l'infection à S. aureus. Des souris femelles BALB/c (âgées de 6 à 8 semaines, 18 à 20 g) ont été achetées auprès de Zhejiang Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. Centre clinique de santé. Des conditions de logement de cycle obscurité/lumière 12 h, température ambiante 20–26 °C, humidité 40–60 % ont été appliquées sur les souris.

Des anticorps de SaClpP (1:5 000, Cat#C11185), SaFtsZ (1:5 000, Cat#C11186) et SaGAPDH (1:5 000, Cat#C1399) ont été générés par Shanghai Immune Biotech Ltd en utilisant la protéine purifiée comme antigène et validé par des expériences ELISA. Anticorps de HsClpP (1:2,000, Clo#EPR7133, Cat#ab124822, Lot#GR3210822-8, Abcam), β-actine (1:5,000, Clo#2D4H5, Cat#66009-1-Ig, Lot#10004156, Proteintech ), IgG anti-lapin de chèvre conjuguée à la HRP (1:10 000, Cat#CW0103, Cwbio) et IgG anti-souris de chèvre conjuguée à la HRP (1:10 000, Cat#CW0102, Cwbio) ont été achetées dans le commerce.

Les souches bactériennes utilisées dans cette étude sont fournies dans le tableau supplémentaire 2. Milieu de bouillon de soja tryptique (TSB, OXOID), gélose tryptone soja (TSA, OXOID), Brian Heart Infusion (BHI, OXOID), gélose Mueller-Hinton (MHA, Dalian Meilun Biotech) et Mueller-Hinton Broth (MHB, Dalian Meilun Biotech) ont été utilisés pour la culture de S. aureus. Luria Bertani (LB) dans des milieux de bouillon ou de gélose LB a été utilisé pour la croissance d'Escherichia coli (E. coli).

ZG180, (R)- et (S)-ZG197 ont été synthétisés en laboratoire et entièrement caractérisés. ONC212 et ADEP 4 ont été achetés auprès de Topscience et ChemPartner (Shanghai, Chine), respectivement. Les antibiotiques de vancomycine, spectinomycine, érythromycine, ciprofloxacine, rifampicine, tétracycline, norfloxacine, clindamycine et gentamicine ont été achetés auprès de Dalian Meilun Biotech. L'oxacilline a été achetée chez Sigma-Aldrich. La tétracycline anhydre (ATC) a été achetée chez APExBIO.

Les lignées cellulaires HEK 293T/17 (CRL-11268) et HK-2 (CRL-2190) ont été achetées auprès de l'American Type Culture Collection (ATCC). Les cellules ont été cultivées dans du milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM, Corning) additionné de 10 % de sérum bovin fœtal (FBS, GIBCO) et de 1 % de pénicilline-streptomycine (Corning). Les cellules ont été cultivées à 37 ° C dans un incubateur à atmosphère humidifiée contenant 5% de CO2 (Thermo Scientific). Toutes les cellules ont été validées par un profilage à répétition en tandem court (STR) et ont été régulièrement vérifiées pour être exemptes de mycoplasmes.

Le plasmide pET28b-SaClpP a été utilisé pour l'expression de SaClpP49. Les souches E. coli BL21 (DE3) Gold ont été transformées avec le plasmide en présence de 30 μg/mL de kanamycine. Lorsque la DO600 (absorbance à la longueur d'onde de 600 nm) atteint 0, 6 à 0, 8, l'expression de la protéine a été induite par 0, 5 mM d'isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) à 30 ° C pendant 4 h. Ensuite, les culots cellulaires ont été récoltés et stockés à -80 ° C. Les cellules ont été lysées et le surnageant a été soumis à une colonne HisTrapTM HP (GE Healthcare) de 5 ml dans un tampon de liaison (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 100 mM et imidazole 50 mM), puis élué avec un tampon d'élution (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 100 mM et imidazole 400 mM). Les protéines éluées ont été concentrées avec des filtres Amicon Ultra Centrifugal avec un seuil de coupure de 10 kDa (Merck-Millipore) et soumises à une filtration sur gel sur un système de purification AKTA avec une colonne HiLoad 16/60 Superdex 200 (GE Healthcare) dans 20 mM HEPES, pH 7,0 et NaCl 100 mM. La mutation dirigée de SaClpPI91W a été établie selon le kit de mutagenèse dirigée Quikchang (Stratagene). Une procédure similaire a été appliquée sur la purification de SaClpPI91W.

Le plasmide pET28a-SaFtsZ a été utilisé pour l'expression de SaFtsZ49 et transformé dans E. coli BL21 (DE3) Gold en présence de 30 μg/mL de kanamycine. Lorsque la DO600 atteint 0,6, l'expression de SaFtsZ a été induite par 0,5 mM d'IPTG pendant 12 h à 16 °C. Ensuite, les culots cellulaires ont été lysés et le surnageant a été lié avec une colonne HisTrapTM HP de 5 ml dans un tampon de liaison (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 200 mM et imidazole 50 mM), puis élué avec un tampon d'élution (Tris 50 mM -HCl, pH 8,0, NaCl 200 mM et imidazole 400 mM). Les protéines éluées ont été concentrées avec des filtres Amicon Ultra Centrifugal avec un seuil de coupure de 10 kDa (Merck-Millipore) et ont été stockées à -80 ° C.

Le plasmide pPSUMO-CLPPΔN56 a été transformé dans des cellules E. coli Rosetta (DE3) pour l'expression de HsClpP40. Les cellules ont été cultivées à 37 ° C jusqu'à ce que la DO600 atteigne 0, 6-0, 8 et l'expression de HsClpP a été induite par 0, 5 mM d'IPTG à 37 ° C pendant 4 h. Les cellules ont été lysées dans un tampon de liaison (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, NaCl 500 mM, imidazole 10 mM et 10 % de glycérol). Le surnageant a ensuite été passé à travers une colonne HisTrapTM HP de 5 ml. Après lavage avec un tampon de liaison, la protéine cible a été éluée avec un tampon d'élution (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, NaCl 500 mM, imidazole 500 mM et 10 % de glycérol). La protéine collectée a ensuite été concentrée et remise en suspension dans un tampon de liaison. Ensuite, la protéase ULP1 a été ajoutée pour cliver l'étiquette His-SUMO N-terminale à 4 ° C pendant une nuit sous agitation douce. Les fractions restantes ont ensuite été passées à travers la colonne HisTrapTM HP pour éliminer l'étiquette His-SUMO et l'ULP1 étiquetée His. Une purification supplémentaire a été effectuée sur une colonne HiLoad 16/60 Superdex 200 dans Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, NaCl 500 mM et 5 % de glycérol. La construction de plasmides pour HsClpPW146A, HsClpPΔC et HsClpPW146AΔC a été réalisée selon le kit de mutagenèse dirigée Quikchang. Les purifications de HsClpPW146A, HsClpPΔC et HsClpPW146AΔC étaient similaires à celles de HsClpP. Les protéines ont été stockées à -80 °C dans du glycérol à 30 %.

Les séquences de l'amorce utilisées pour construire des plasmides pour les mutants sont présentées comme suit :

SaclpPI91W-F : GATGTTCAAACATGGTGTATCGGTATGGC

SaclpPI91W-R : GCCATACCGATACACCATGTTTGAAACATC

HsCLPPW146A-F : CCGATTTGTACCGCCTGTGTGGGTC

HsCLPPW146A-R : GACCCACACAGGCGGTACAAATCCGG

HsCLPPΔC-F : GTGCTGGTCATTAGCCGCAGGATGGTGAAGATG

HsCLPPΔC-R : CATCTTCACCATCCTGCGGCTAATGAACCAGCAC

Dix microgrammes de SaClpP, SaClpPI91W, HsClpP ou HsClpPW146A ont été dissous dans 50 μL de tampon contenant 25 mM HEPES-KOH (pH 7,6), 200 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 10 % (v/v) de glycérol et 2 mM DTT, tandis que 10 μg HsClpPΔC ou HsClpPW146AΔC ont été dissous dans 50 μL de tampon contenant 25 mM HEPES-KOH (pH 7,6), 5 mM MgCl2, 5 mM KCl, 0,03% Tween-20, 10% glycérol et 2 mM DTT. Différentes concentrations de composé (concentration finale de DMSO à 1 %) ont été préincubées à température ambiante pendant 15 min. Ensuite, 0,72 mg/mL d'α-caséine ont été ajoutés et la réaction a été effectuée à 37 °C pendant 2 h. Les échantillons ont été mélangés avec du tampon de chargement SDS et analysés par SDS-PAGE à 12 % suivi d'une coloration au bleu de Coomassie Brilliant R-250. Les valeurs EC50 ont été calculées par GraphPad Prism 8 à partir de trois réplicats biologiques.

La protéine tétradécamérique SaClpP (0,6 μM) dans un tampon PD (25 mM HEPES-KOH (pH 7,6), 200 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 10 % (v/v) glycérol et 2 mM DTT) et composés (40 μM) ont été ajoutés dans les plaques 384 puits noires à fond plat. Après incubation à 37 ° C pendant 30 min, le substrat FITC-caséine marqué par fluorescence (0, 048 mg / ml) (Sigma) a été ajouté et la réaction d'hydrolyse a été initiée à 37 ° C. Après 2 h, les signaux de fluorescence ont été enregistrés à la longueur d'onde de 485 nm pour l'excitation et 535 nm pour l'émission à l'aide d'un lecteur de microplaques (TECAN).

ZG180 et (R) - et (S) -ZG197 ont été synthétisés dans ce laboratoire et les méthodes de synthèse ainsi que les caractérisations sont fournies dans les méthodes supplémentaires et la Fig. 7–23 supplémentaire.

Les protéines SaClpP et HsClpP ont été cristallisées par la méthode de diffusion de vapeur en goutte assise à 16 °C. L'échantillon de 10 mg/mL de protéine a été mélangé avec une concentration de 5 fois du composé de ZG180, (R)- ou (S)-ZG197 (contient 5 % de DMSO) et incubé pendant 30 min à 4 °C. Les gouttes contenaient 1 ou 2 μL d'échantillon de SaClpP et 1 μL de solution réservoir de 30 % (v/v) de 2-méthyl-2,4-pentanediol, 0,1 M d'acétate de sodium/HCl (pH 8,0), 20 mM de chlorure de calcium en présence de ZG180, ou 1 μL solution réservoir de 30% v/v (+/−)-2-méthyl-2,4-pentanediol, acétate de sodium trihydraté 0,1 M (pH 4,6), chlorure de sodium 200 mM en présence de (R )- et (S)-ZG197. L'échantillon de HsClpP à 10 mg/mL a été incubé en présence d'une concentration 5 fois supérieure de ZG180 sur de la glace pendant 30 min et mélangé avec une solution réservoir de 20 % p/v de polyéthylène glycol 3350, malonate de sodium 0,2 M (pH 5,0). Ces cristaux ont grandi après une semaine à plus d'un mois. Ensuite, les cristaux ont été pêchés et trempés dans du glycérol à 20% (v/v) pendant 30 s suivi d'un stockage dans de l'azote liquide.

Les données de diffraction de ZG180/SaClpP et (R)-ZG197/SaClpP ont été collectées via Bluice sur la ligne de lumière BL19U155 de Shanghai Synchrotron Radiation Facility (SSRF). Les données radiographiques ont été traitées via la suite de programmes HKL2000. Les données de diffraction de ZG180/HsClpP ou (S)-ZG197/SaClpP ont été collectées via Finback sur la ligne de lumière SSRF BL02U1 et traitées automatiquement par Aquarium56. Les structures ont été résolues en utilisant le SaClpP (code PDB 3STA) et HsClpP (code PDB 1TG6) comme modèle de recherche et les modèles ont été construits en COOT43,48,57. Enfin, les données ont été affinées avec le programme REFMAC558. Les réflexions libres ont été automatiquement sélectionnées et appliquées dans tous les raffinements. Les alignements de structure ont été effectués dans PyMOL59.

La dégradation de SaFtsZ a été analysée en SDS-PAGE in vitro. En bref, 10 μg de SaClpP ont été dissous dans 50 μL de tampon PD. Après addition de différentes concentrations de composé (concentration finale de DMSO à 1%), le mélange a été incubé à température ambiante pendant 15 min. Ensuite, SaFtsZ (1,5 μM) a été ajouté et la réaction a été effectuée à 37 ° C pendant 2 h. Les échantillons ont été mélangés avec du tampon de chargement SDS et analysés par SDS-PAGE à 12 % suivi d'une coloration au bleu de Coomassie Brilliant R-250. Les valeurs EC50 ont été calculées par GraphPad Prism 8 à partir de trois réplicats biologiques.

Le lysat cellulaire de la souche 8325-4/ΔclpP a également été utilisé dans le test de dégradation SaFtsZ. Une culture de staphylocoques d'une nuit de 8325-4/ΔclpP a été diluée au 1/500 et cultivée jusqu'à la phase exponentielle précoce (OD600 = 0,4–0,6) à 37 °C. La culture a ensuite été lavée avec du tampon PD trois fois, suivie d'une lyse cellulaire en utilisant 0,75 U de lysostaphine (Sigma). Ensuite, le lysat cellulaire a été centrifugé à 12 396 × g et le surnageant a été collecté et divisé en 50 μL. De l'albumine de sérum bovin neuf micromolaires (BSA, Dalian Meilun Biotech), la protéine SaClpP ou HsClpP et diverses concentrations de composé ont été ajoutées au système. Après une incubation à 37 °C pendant 2 h, les échantillons ont été mélangés avec du tampon de charge SDS et chauffés à 100 °C pendant 10 min. Ensuite, les échantillons ont été chargés sur le SDS-PAGE pour détecter l'abondance cellulaire de SaFtsZ. Les protéines ont été transférées sur membrane de nitrocellulose (Millipore) et bloquées avec du TBST contenant 5% de lait écrémé à température ambiante pendant 1 h, suivi d'une incubation avec les anticorps primaires de SaFtsZ (1:5 000) et SaGAPDH (1:5 000) à 4° C du jour au lendemain. Après lavage avec du TBST, de l'IgG de chèvre anti-lapin marquée au HRP (1:10 000) a été ajoutée pour l'analyse Western Blot.

La protéine SaClpP ou SaClpPI91W a été dissoute dans 100 mM HEPES, pH 7,0, 100 mM NaCl à une concentration finale de 2 μM (concentration monomérique), tandis que HsClpP, HsClpPΔC, HsClpPW146A ou HsClpPW146AΔC a été dissous dans le tampon de dosage contenant 20 mM Tris-HCl , pH 7,5, NaCl 500 mM et glycérol 5 % jusqu'à une concentration finale de 2 μM (concentration monomère). Des composés à des concentrations variables (contenant 1 % de DMSO) ont été ajoutés dans le tampon de dosage. Après incubation à température ambiante pendant 10 min, 5 x colorant SYPRO Orange (Invitrogen) ont été ajoutés dans chaque échantillon. La détection a été enregistrée dans un système en temps réel CFX96 (Bio-Rad) à la longueur d'onde de 492 nm pour l'excitation et de 610 nm pour l'émission. Les échantillons ont été chauffés de 25 °C à 95 °C à une vitesse de 1 °C/min. L'analyse des données a été effectuée avec le logiciel Bio-Rad CFX Manager et GraphPad Prism 8. La Tm des protéines dans les groupes traités avec le composé a été comparée à celle du groupe DMSO.

Les expériences ITC ont été réalisées dans un tampon contenant 20 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7,0, 5 % DMSO à 25 °C et sous agitation constante à 750 tr/min sur un système MicroCal iTC200 (GE Healthcare) selon la méthode rapportée44,60. Les protéines et les composés ont été dissous dans exactement le même tampon. La cellule a été remplie de 50 μM (R) - ou (S) - ZG197 et la seringue a été remplie de SaClpPI91W à 500 μM ou de SaClpP à 700 μM. Après un équilibrage automatique du système, 2 μL de solution dans une seringue ont été injectés dans la cellule pour déclencher une réaction de liaison et produire la séquence de pic caractéristique dans le signal enregistré. L'analyse des données, y compris la correction de la ligne de base et l'évaluation, a été effectuée avec OriginPro 8.5 ITC. Des ajustements ont été effectués en considérant toutes les injections sauf la première injection pour calculer la chaleur maximale et la valeur de la constante de dissociation à l'équilibre (Kd).

Cette expérience a été réalisée en utilisant Octet RED96 (ForteBio). Les protéines SaClpP et HsClpP ont été biotinylées dans du tampon PBS à température ambiante pendant 1 h. Ensuite, les protéines biotinylées ont été collectées à l'aide d'une colonne de dessalage PD MiniTrap™ G-25 (cytiva). Les biocapteurs de streptavidine ont été incubés dans du PBST (PBS avec 0, 5% de Tween-20) contenant 0, 5% de DMSO pendant 10 min, suivi d'un chargement avec 50 μg / mL de SaClpP ou HsClpP biotinylé. Le contrôle de référence a appliqué un jeu de capteurs en double qui a été incubé uniquement dans du PBST avec 0,5 % de DMSO. Diverses concentrations de (R)- et (S)-ZG197 ont été utilisées pour calculer la courbe de liaison. La détection a été réalisée avec un protocole standard dans des plaques noires à 96 puits avec un volume total de 200 μL à 30 °C. Les données BLI ont été collectées à l'aide d'Octet Acquisition 11.0. Les signaux ont été analysés par un protocole de soustraction à double référence pour calculer la cinétique de liaison en utilisant Octet Analysis 11.0. Les valeurs de Kd ont été calculées à partir de la courbe d'ajustement stationnaire-statique.

Pour construire le plasmide pour l'expression constitutive de SaClpP dans S. aureus, un fragment d'ADN, couvrant le gène clpP et ses 29 paires de bases en amont, a été amplifié à partir de l'ADN génomique de S. aureus 8325-4 et cloné dans pYJ335. Le mutant SaclpPI91W a été construit selon le kit de mutagenèse dirigée QuikChange II avec les amorces SaclpPI91W-F et SaclpPI91W-R. Pour la maintenance du plasmide, 100 μg/mL d'ampicilline ont été utilisés dans E. coli et 10 μg/mL d'érythromycine ont été utilisés dans S. aureus. Le plasmide a été extrait de DH5α puis transformé dans des cellules S. aureus RN4220 électrocompétentes, à partir desquelles le plasmide a été extrait à nouveau et finalement transformé dans des cellules S. aureus 8325-4/ΔclpP électrocompétentes. L'érythromycine a été utilisée à 10 µg/mL pour la sélection du plasmide, et 1 ng/mL d'ATC a été ajouté pour induire l'expression de la protéine.

Amorce SaclpP-F1 : GTAACAGTTATTACAAGGAGG

Amorce SaclpP-R1 : AGGGGGCCTTATTTTGTTTCAGG

Amorce SaclpPI91W-F : GATGTTCAACATGGTGTATCGGTATGGC

Amorce SaclpPI91W-R : GCCATACCGATACACCATGTTTGAAACATC

La surexpression de la protéine a été détectée par Western blot. Une culture de bactéries d'une nuit a été diluée à 1:1000 dans du TSB avec une aération à 220 tr/min. Lorsque la DO600 a atteint 0,6, 1 ml de culture a été collecté et centrifugé à 12 396 × g pendant 3 min. Les sédiments ont été lavés trois fois avec du PBS et remis en suspension dans 100 μL de PBS avec 0, 75 U de lysostaphine (Sigma) à 37 ° C pendant 30 min. Les échantillons ont ensuite été centrifugés à 12 396 × g, 4 °C pendant 30 min et les surnageants ont été collectés. La concentration en protéines a été quantifiée avec le kit de dosage des protéines BCA (Beyotime). Les échantillons ont été dilués avec un tampon de chargement SDS, chauffés à 100 ° C pendant 10 min et chargés sur le SDS-PAGE pour analyse. Les protéines ont été transférées sur membrane de nitrocellulose (Millipore) et bloquées avec du TBST contenant 5% de lait écrémé à température ambiante pendant 1 h, suivi d'une incubation avec les anticorps primaires de SaClpP (1:5 000) et SaGAPDH (1:5 000) à 4° C du jour au lendemain. Des IgG de chèvre anti-lapin marquées à la HRP (1:10 000) ont ensuite été ajoutées. La chimiluminescence améliorée (ECL) a été utilisée pour l'autoradiographie et les images ont été capturées avec GE ImageQuantLAS4000.

Les souches de S. aureus 8325-4 avec des antécédents génétiques de clpP, ΔclpP et le mutant clpP ou I91W complémenté ont été testées pour la dégradation de SaFtsZ dans les cellules intactes. Une culture d'une nuit a été diluée à 1:200 et incubée avec des concentrations variables de chaque composé (0, 5, 10 et 20 μM, concentration finale de DMSO à 1%). Lorsque la DO600 atteint 0,7, 300 μg/mL de spectinomycine ont été ajoutés et la réaction a été conduite à 37 °C, 220 tr/min pendant 3 h. Ensuite, 1 ml de chaque échantillon a été prélevé et lavé trois fois avec du PBS. Les cellules ont été remises en suspension et lysées avec 0,75 U de lysostaphine à 37 ° C pendant 30 min. Le surnageant des extraits cellulaires lysés a été séparé et la concentration des protéines a été déterminée à l'aide du kit de dosage des protéines BCA, suivi d'une analyse Western blot. L'analyse quantitative a été réalisée à l'aide du logiciel ImageJ. Le degré de dégradation de SaFtsZ a été déterminé en mesurant l'intensité de la bande de SaFtsZ par rapport à SaGAPDH et le panel DMSO a été considéré comme 1,0.

Des colonies uniques de S. aureus 8325-4 ont été prélevées et cultivées au TSA sous agitation pendant la nuit. La culture a été diluée à 1:1000 et cultivée jusqu'à OD6oo = 0,6. Ensuite, la culture a été remise en suspension dans du PBS et 5 × 106 cellules ont été étalées sur des plaques MHA contenant (R)-ZG197, (S)-ZG197, ADEP 4 ou ONC212 à 4 × MIC de chaque composé. Après 24 h, les colonies résistantes ont été prélevées au hasard pour les déterminations de CMI et le séquençage. Le gène SaclpP a été amplifié par PCR et séquencé pour déterminer le site mutant.

Les séquences des amorces utilisées pour amplifier SaclpP sont présentées comme suit :

Amorce SaclpP-F2 : GTATTACAAGGAGGAAAT

Amorce SaclpP-R2 : CAGACAGCTTAGTCTACTC

Des cultures d'une nuit de souches de S. aureus ont été diluées à 1: 200 dans du milieu TSB frais et incubées avec du DMSO ou 20 μM (R) - et (S) -ZG197 puis secouées à 37 ° C, 220 tr / min pendant 3 h. Les cultures ont été lavées trois fois avec du PBS et remises en suspension à une DO6oo de 1,5. Ensuite, 50 μL de cultures ont été prélevées et fixées sur un couvercle en verre de 13 mm avec 300 μL de glutaraldéhyde à 2,5% (TED PELLA) dans une plaque à 24 puits (Corning) à 4 ° C pendant la nuit. Le jour suivant, le glutaraldéhyde dans chaque puits a été retiré et lavé avec du PBS trois fois. Ensuite, les échantillons ont été soigneusement teints avec de l'acide osmique pendant 30 min, suivis d'un lavage avec ddH2O trois fois. Les échantillons ont été déshydratés dans une série graduée d'éthanol (30, 50, 70, 80, 95, 100%) pendant 10 min avec une agitation douce pour chaque étape. Les échantillons ont ensuite été soumis à un séchage au point critique avec du CO2 liquide (Leica EM) pour conserver l'aspect d'origine des échantillons. Les échantillons séchés ont été recouverts d'un film d'or par pulvérisation cathodique (Leica EM). Les échantillons ont été imagés dans un FEI Quanta 250 à une tension d'accélération de 15 kV. Les images ont été enregistrées et le contraste et la luminosité ont été ajustés avec Adobe Photoshop CS5.

Des cultures d'une nuit de S. aureus 8325-4 ou des souches SaclpPI91W sauvées ont été diluées à 1:200 dans du TSB frais et ont été incubées avec du DMSO ou des composés 10 μM, y compris (R) -ZG197, (S) -ZG197 et ONC212, pour 2h. Un millilitre de chaque culture a été recueilli et lavé trois fois avec du PBS. Ensuite, les échantillons ont été remis en suspension dans du PBS contenant des inhibiteurs cocktail (Sangon Biotech) et divisés en aliquotes de 50 μL et chauffés à différentes températures pendant 3 min à l'aide d'un thermocycleur (BIO-RAD). Les bactéries ont ensuite été lysées avec 0,75 U de lysostaphine à 37 ° C pendant 30 min, suivies de trois cycles de congélation-décongélation avec de l'azote liquide pour casser complètement les bactéries. Les lysats solubles ont été collectés par centrifugation à 12 396 × g pendant 20 min à 4 °C et les surnageants ont été analysés par Western blot. Des anticorps primaires de SaClpP (1:5 000) et SaGAPDH (1:5 000) ont été utilisés. Trois expériences indépendantes ont été réalisées et l'un des résultats représentatifs est présenté.

Les cellules HEK 293 T/17 ont été digérées par la trypsine et collectées. Les sédiments cellulaires ont été remis en suspension dans du PBS contenant des cocktails inhibiteurs (Sangon Biotech) et lysés par trois cycles de congélation-décongélation avec de l'azote liquide. Les échantillons lysés ont ensuite été centrifugés à 12 396 × g pendant 30 min pour éliminer les débris. Après centrifugation, le surnageant a été incubé avec des composés 10 μM, y compris (R)-ZG197, (S)-ZG197 et ONC212, pendant 20 min, puis transféré dans les tubes PCR de 0,2 ml, suivi d'une dénaturation aux températures indiquées pendant 3 min. Puis les surnageants solubles ont été récupérés par centrifugation et analysés par western blot. Des anticorps primaires de HsClpP (1: 2 000) et de β-actine (1: 5 000) ont été utilisés. Trois expériences indépendantes ont été réalisées et l'un des résultats représentatifs est présenté.

Les cultures ont été cultivées dans du milieu MHB à 37 ° C avec agitation à 220 tr/min pendant une nuit jusqu'à ce que la DO600 atteigne 0,4-0,6, puis diluées dans du milieu MHB pour donner une DO600 finale de 0,025. Des composés à diverses concentrations ont été ajoutés à des cultures bactériennes diluées (volume final de 100 µL/puits et concentration finale de DMSO de 1 %) en triple. La concentration la plus faible d'un antibiotique inhibant la croissance visible des bactéries a été enregistrée après incubation à 37 ° C pendant 18 h. Les valeurs de CMI ont été déterminées par trois expériences indépendantes.

Une culture d'une nuit de USA300 a été diluée dans du TSB avec une DO600 finale de 0,025 et cultivée jusqu'à la phase logarithmique moyenne (DO600 de 0,6) à 37 °C, 220 tr/min. Par la suite, les cellules ont été diluées à 1 × 106 UFC/mL dans du TSB et traitées avec du DMSO, de la vancomycine (20 μg/mL, 10 × MIC), (R)-ZG197 (5 μg/mL, 10 × MIC), (S) -ZG197 (80 μg/mL, 10 × MIC) ou ONC212 (5 μg/mL, 10 × MIC). Après 6 h d'incubation à 37 ° C, 220 tr/min, 200 μL de milieu de culture ont été prélevés et lavés trois fois avec du PBS. Des dilutions de chaque condition ont ensuite été étalées en l'absence de composés et cultivées sur des plaques TSA à 37 ° C pendant une nuit. Les UFC ont été mesurées en comptant le nombre de colonies le jour suivant.

Deux essais ont été effectués pour tester les effets de (R)- et (S)-ZG197 sur l'éradication des persistants de SARM. Tout d'abord, des cellules de S. aureus se développant en phase stationnaire ont été appliquées61. Après une nuit de culture, des SARM USA300 en phase stationnaire ont été préparés dans du bouillon BHI et incubés en présence de (R)-ZG197 (10 μg/mL), (S)-ZG197 (80 μg/mL), ciprofloxacine (8 μg/mL) , ou rifampicine (0,4 μg/mL) à 37 °C et 220 tr/min avec aération. À chaque point de temps indiqué (0, 24, 48 et 72 h), 100 μL de culture ont été prélevés et centrifugés à 12 396 × g pendant 2 min. Ensuite, le mélange a été lavé trois fois avec du PBS. Des dilutions en série de 10 fois ont été effectuées et 10 μL de chaque dilution ont été prélevés et déposés sur des plaques TSA. Toutes les plaques ont été placées à 37°C pendant une nuit. Les UFC ont été mesurées en comptant le nombre de colonies le jour suivant.

Le deuxième test de cellules persistantes a été effectué à l'aide de l'analyse de destruction biphasique23. Pendant la nuit, la culture USA300 en phase stationnaire a été diluée à 1:100 dans du TSB. Les bactéries ont d'abord été incubées avec de la ciprofloxacine (8 μg/mL, 10 × MIC) pendant 6 h à 37 °C avec aération à 220 tr/min, et les cellules restantes ont formé des persistants survivants. Ensuite, composés à 10 × MIC, y compris (R)-ZG197 (10 μg/mL), (S)-ZG197 (80 μg/mL), ADEP 4 (5 μg/mL), ciprofloxacine (8 μg/mL), ou rifampicine (0,4 μg/mL), ont été ajoutés et 100 μL d'échantillons ont été prélevés au moment indiqué (0, 2, 4, 6, 8, 12, 24 et 48 h) et centrifugés à 12 396 × g pendant 2 min. Ensuite, les échantillons ont été remis en suspension dans du PBS. Les UFC ont été mesurées en comptant le nombre de colonies le jour suivant.

La toxicité des composés sur les lignées cellulaires 293T/17 et HK-2 a été réalisée par dosage du bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT). Des cellules de mammifères (3000 cellules/puits) ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits laissées adhérer pendant la nuit et traitées avec une série diluée d'ICG-001, (S)-ZG197, (R)-ZG197 ou ONC212 pendant 72 h. Par la suite, 10 μL de solution MTT préparée (5 mg/mL dans du PBS) ont été ajoutés à chaque puits et les cellules ont ensuite été incubées pendant 4 h supplémentaires à 37 °C. Après élimination du surnageant, le précipité de formazan dans chaque puits a été dissous dans du DMSO et l'absorbance a été mesurée à une longueur d'onde de 490 nm par un lecteur de plaque Tecan Spark 10 m. Le DMSO a été utilisé comme témoin et sa viabilité a été considérée comme étant de 100 %. Les valeurs de CI50 ont été calculées en ajustant les courbes dose-réponse. Toutes les expériences ont été réalisées en triple.

La signalisation Wnt/β-caténine a été détectée à l'aide des dosages de rapporteur TOPFlash/FOPFlash comme décrit précédemment avec des modifications39. TOPFlash (# 21-170, Millipore) a été utilisé comme rapporteur sensible à Wnt et FOPFlash (# 21-169, Millipore) était un rapporteur mutant insensible à Wnt. Environ 1,5 × 105 cellules HEK 293 T/17 ou HK-2 ont été ensemencées dans des plaques à 24 puits. Après fixation, les cellules ont été transfectées avec 500 ng de reporter Firefly TOPFlash ou FOPFlash en utilisant Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA) conformément aux instructions du fabricant. Pendant ce temps, 50 ng du rapporteur Renilla pRL-TK (Promega) ont été co-transfectés en tant que contrôle interne pour corriger les différences d'efficacité de transfection et de récolte. Après 6 h post-transfection, le milieu de culture a été changé en milieu de croissance DMEM en présence de LiCl 20 mM et des composés aux concentrations indiquées. Après 24 h, les cellules ont été lysées et détectées par le système de dosage Dual-Luciferase Reporter (#E1910, Promega) conformément aux instructions du fabricant. L'activité luciférase Firefly (TOPFlash ou FOPFlash) a été normalisée avec l'activité luciférase Renilla (pRL-TK). L'activité de signalisation Wnt a été représentée sous forme de valeurs TOPFlash/FOPFlash normalisées.

Des poissons zèbres (âgés de 7 à 11 mois, 300 ± 50 mg, quel que soit leur sexe) ont été maintenus dans un réservoir de 10 L avec une alimentation régulière pendant au moins trois jours avant d'être soumis à des expériences. Les profils de sécurité ont été réalisés en injectant par voie intrapéritonéale le poisson zèbre non infecté (n = 11 par groupe) avec 25, 50 ou 100 mg/kg de composés (dissous dans 5 % de DMSO, 20 % de PEG 300, 5 % de solutol et 70 % de PBS) . Pour la détermination d'une charge staphylococcique appropriée pour l'infection, le poisson zèbre a été administré avec une série d'UFC de bactéries et les taux de survie ont été surveillés pendant 5 jours. Un poisson zèbre de groupe a été injecté par voie intrapéritonéale avec le même volume de PBS (8 μL) que le contrôle à blanc.

Pour étudier l'efficacité anti-infectieuse des composés, les poissons zèbres ont reçu une injection intrapéritonéale de souches de S. aureus (USA300, Newman, Newman ΔclpP ou MRSA XJ049) aux UFC indiquées. Après 30 minutes après l'infection, les poissons zèbres ont été divisés au hasard en différents groupes suivis de l'administration de composés à une dose de 25 ou 50 mg/kg et d'un véhicule témoin. Les taux de survie des poissons zèbres ont été enregistrés pendant 5 jours.

Le modèle d'infection a été établi selon la méthode rapportée précédemment avec quelques modifications62. Le dos de souris (âgées de 6 à 8 semaines, 18-20 g) a été rasé et traité avec de la crème dépilatoire un jour avant l'infection. Des cultures d'une nuit de S. aureus USA300 ont été diluées à 1:1000 et cultivées jusqu'à OD600 à 0,6. Ensuite, les cultures ont été lavées trois fois avec du PBS et remises en suspension à une concentration de 5 × 107 UFC/mL. Avant l'infection, les souris ont été anesthésiées avec une injection intrapéritonéale de 70 mg/kg de pentobarbital sodique. Une aliquote de 50 µL de suspension de S. aureus USA300 (contenant 2,5 × 106 UFC) a été injectée par voie sous-cutanée dans la zone rasée. 16 h après l'infection, les souris ont été réparties au hasard en différents groupes (n = 9 par groupe). La surface de la lésion a été mesurée et calculée à l'aide de la formule A = π(L/2) × W/2 (A, surface ; L, longueur ; W, largeur). La différence des zones de lésion initiales n'a pas de signification dans chaque groupe. Ensuite, 50 µL de composés à 7,5 mg/kg (dissous dans 5 % de DMSO, 20 % de PEG 300, 5 % de solutol et 70 % de PBS) et le véhicule (comme contrôle négatif) ont été injectés par voie sous-cutanée près de la peau infectée. Les traitements ont été appliqués deux fois par jour pendant 3 jours. Les souris ont ensuite été sacrifiées et la peau a été séparée du fascia sous-jacent et du tissu musculaire. L'un des neuf échantillons de peau de chaque groupe a été utilisé au hasard et fixé dans du paraformaldéhyde à 4 % et inclus dans de la paraffine. Des sections minces ont été coupées et colorées avec H&E pour des observations microscopiques. Les huit échantillons de peau infectés restants dans chaque groupe ont été excisés et pesés de manière aseptique, puis homogénéisés dans 1 ml de PBS. L'homogénat dilué en série a été étalé sur des plaques TSA et incubé à 37°C pendant une nuit. Les numérations bactériennes ont été exprimées en log10 UFC/mg de tissu.

Toutes les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide de GraphPad Prism 8 (logiciel GraphPad). Des tests de log-rank ont ​​été réalisés pour comparer les deux courbes de survie. Des tests t de Student non appariés bilatéraux ont été effectués pour comparer les moyennes entre les groupes. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD. Les valeurs P sont indiquées sur les figures. Le nombre d'expériences/souris/échantillons indépendants est mentionné dans les légendes des figures. Toutes les tentatives de réplication réussissent. Tous les transferts et gels ont été réalisés en triple exemplaire et une seule image expérimentale est présentée. Des expériences d'infection cutanée murine, de coloration SEM et H&E ont été réalisées une fois. Au moins 5 images représentatives de SEM ont été enregistrées à partir de chaque échantillon. Trois images représentatives de la coloration H&E ont été prises dans chaque échantillon et une est montrée. Toutes les images enregistrées sur coloration SEM ou H&E ont indiqué une tendance similaire.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les coordonnées atomiques et les données des facteurs de structure générées dans cette étude ont été déposées dans la Protein Data Bank (PDB, www.pdb.org) sous le code d'accession 7WH5 pour ZG180/HsClpP, 7WID pour ZG180/SaClpP, 7XBZ pour (R)-ZG197 /SaClpP et 7WGS pour la structure (S)-ZG197/SaClpP, respectivement. D'autres données structurelles aux rayons X utilisées dans cette étude sont disponibles dans la base de données PDB sous le code d'accession 6TTY, 6TTZ, 3STA et 1TG6. La séquence d'acides aminés peut être trouvée au National Center for Biotechnology Information (NCBI) avec le numéro d'accession NP_006003 pour HsClpP, CAA06443 pour MoClpP, NP_001018520 pour DaClpP, KFL07692 pour SaClpP et CAD6014684 pour EcClpP. Toutes les données pertinentes générées dans cette étude sont fournies dans le fichier Informations supplémentaires et données sources. Les données sources sont fournies avec ce document. Les données sont disponibles sur demande auprès des auteurs correspondants. Les données sources sont fournies avec ce document.

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Nous sommes reconnaissants au Dr Hanne Ingmer (The Royal Veterinary and Agricultural University, Danemark) pour le don de S. aureus NCTC 8325-4 et 8325-4/ΔclpP et au Dr Jiahai Zhou (Shanghai Institute of Organic Chemistry, Chine) pour le don du vecteur pPSUMO. Nous remercions le personnel des lignes de lumière BL19U1 et BL02U1 de l'installation de rayonnement synchrotron de Shanghai pour son soutien à la collecte de données. Nous remercions le personnel du département des modèles d'animaux de laboratoire du centre clinique de santé publique de Shanghai de l'université de Fudan pour le soutien de l'établissement. Ce travail a été financé par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (22037007, 81861138046 et 21725801 à C.-GY et 22107109 à TZ).

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Bingyan Wei, Tao Zhang, Pengyu Wang.

École des sciences et technologies pharmaceutiques, Institut d'études avancées de Hangzhou, Université de l'Académie chinoise des sciences, Hangzhou, 310024, Chine

Bingyan Wei, Pengyu Wang, Yihui Pan, Lefu Lan et Cai-Guang Yang

State Key Laboratory of Drug Research, Center for Chemical Biology, Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, 201203, Chine

Bingyan Wei, Tao Zhang, Pengyu Wang, Yihui Pan, Jiahui Li, Lefu Lan et Cai-Guang Yang

Université de l'Académie chinoise des sciences, Pékin, 100049, Chine

Bingyan Wei, Pengyu Wang, Yihui Pan, Jiahui Li, Lefu Lan et Cai-Guang Yang

École des sciences physiques et de la technologie, ShanghaiTech University, Shanghai, 201210, Chine

Weizhong Chen et Quanjiang Ji

Département de médecine de laboratoire, Shanghai East Hospital, Tongji University School of Medicine, Shanghai, 200123, Chine

Min Zhang et Wenjuan Wu

École des sciences de la vie, Université Fudan, Shanghai, 200433, Chine

Jianhua Gan

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C.-GY a conçu le projet et supervisé la recherche. BW a mené des recherches avec l'aide de TZ, PW, YP, JL, WC et MZ ; activateurs synthétisés TZ; QJ, WW, LL, JG et C.-GY ont fourni des agents et des analyses de données ; BW, TZ, PW et C.-GY ont rédigé le manuscrit. Tous les auteurs ont discuté des résultats et commenté le manuscrit.

Correspondance à Cai-Guang Yang.

BW, TZ, PW et C.-GY sont nommés inventeurs de la demande de brevet en instance (CN202210377247.X, auprès de l'Office chinois des brevets) liée au travail décrit. Le déposant du brevet est le Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences. Le statut de la demande est le dépôt officiel. Les structures de ZG180, (R)- et (S)-ZG197 sont couvertes par une demande de brevet. Les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Les protocoles d'expériences d'infection cutanée murine ont été examinés et approuvés par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux (IACUC) du Centre clinique de santé publique de Shanghai. Les expériences ont été réalisées conformément aux directives et réglementations éthiques pertinentes. La licence d'utilisation des animaux de laboratoire (SYXK-HU-2015-0027) est certifiée par le Comité des sciences et technologies de Shanghai.

Nature Communications remercie Youfu Luo, Dacheng Wang, Maria Bewley et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Wei, B., Zhang, T., Wang, P. et al. Thérapie anti-infectieuse utilisant des activateurs spécifiques à l'espèce de Staphylococcus aureus ClpP. Nat Commun 13, 6909 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-34753-0

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Reçu : 12 avril 2022

Accepté : 07 novembre 2022

Publié: 14 novembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-022-34753-0

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