Encapsulation directe de biomolécules en semi | Shijiazhuang Agile Peak Ventures Co., Ltd.

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 21391 (2022) Citer cet article

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La compartimentation peut servir différents objectifs tels que la protection des substances actives biologiques de l'environnement, ou la création d'une combinaison unique de biomolécules pour des applications diagnostiques, thérapeutiques ou d'autres applications de bio-ingénierie. Nous présentons une méthode d'encapsulation directe de molécules dans des microcapsules biocompatibles et semi-perméables à base de diacrylate de poly (éthylène glycol) de faible poids moléculaire (PEG-DA 258). Les microcapsules sont produites à l'aide d'une puce microfluidique PDMS non plane permettant la production en une étape de doubles émulsions d'eau dans le PEG-DA 258 dans l'eau, qui sont polymérisées avec la lumière UV dans une coque poly-PEG-DA 258. Des microcapsules semi-perméables sont obtenues en ajoutant un solvant inerte au PEG-DA 258. En raison de l'hydrophilie favorable du poly-PEG-DA 258, les protéines ne s'adsorbent pas à l'enveloppe de la capsule, et nous démontrons l'encapsulation directe d'enzymes, qui peut également être séché dans les capsules pour préserver l'activité. Enfin, nous tirons parti de la perméabilité de la capsule pour la mise en œuvre d'une cascade de communication à deux couches utilisant des réactions de déplacement de brins d'ADN compartimentés. Ce travail présente l'encapsulation directe de biomolécules actives dans des microcapsules semi-perméables, et nous attendons de notre plateforme qu'elle facilite le développement de cellules artificielles et génère des diagnostics ou des thérapeutiques encapsulés.

Les progrès récents de la microfluidique, de la science des matériaux, de la biologie synthétique et de la bio-ingénierie permettent une ingénierie de précision de compartiments de taille micronique, permettant la manipulation de systèmes biomoléculaires de plus en plus complexes1,2. La technologie microfluidique de gouttelettes permet la production de compartiments polymères avec une taille et une structure définies avec précision, à partir de doubles émulsions ou d'émulsions d'ordre supérieur avec une phase polymérisable comme examiné par Datta et al.3. Un inconvénient des précurseurs polymères utilisés comme phase intermédiaire est que les compartiments polymérisés obtenus sont en général hermétiques à la perméation des solutés, cependant Kim et al.4 ont démontré que des coques polymères semi-perméables peuvent être fabriquées en introduisant un diluant inerte, ou porogène, dans la phase précurseur du polymère. Lors de la polymérisation aux UV, le porogène non réactif est exclu du polymère polymérisant dans un processus appelé séparation de phase induite par polymérisation (PIPS). Cependant, l'inconvénient des polymères utilisés dans cette étude et de la plupart des polymères obtenus à partir de précurseurs non miscibles à l'eau est l'hydrophobicité de l'enveloppe de la capsule polymérisée conduisant à l'adsorption des protéines, et empêchant ainsi l'encapsulation directe des protéines ou des enzymes.

Récemment, il a été montré que le PEG-diacrylate avec un poids moléculaire de 258 g/mol PEG-DA 258 peut être utilisé comme phase médiane polymérisable pour la production de doubles émulsions avec un dispositif capillaire microfluidique5. Les chercheurs ont également montré que le poly-PEG-DA 258 a une hydrophilie similaire aux hydrogels fabriqués à partir de dérivés hydrosolubles de PEG-DA de poids moléculaire plus élevé. Ces caractéristiques favorables leur ont permis d'encapsuler directement le fibrinogène sans adsorption notable sur la coque polymère. Cependant, les capsules produites étaient également hermétiques et empêchaient même les colorants à petites molécules (sel disodique d'érioglaucine : 793 g/mol, huile rouge O : 408 g/mol) de se diffuser hors des capsules, ce qui limiterait considérablement l'utilisation et la plage d'application de de telles gélules.

Pour encapsuler directement des macromolécules biologiquement actives dans des capsules semi-perméables biocompatibles, nous avons combiné les caractéristiques favorables du PEG-DA 258 de faible poids moléculaire avec la formation de pores par PIPS. Dans cette étude, nous avons utilisé un dispositif microfluidique PDMS avec une géométrie à focalisation de flux, coaxiale et non plane qui ne nécessite pas de traitement de surface pour produire des doubles émulsions d'eau dans le PEG-DA 258 dans l'eau. Afin d'obtenir des capsules semi-perméables, nous avons utilisé du PIPS pour former de petits pores dans les enveloppes des capsules. En encapsulant des cargaisons fluorescentes de différentes tailles ou en plaçant des capsules vides dans des solutions contenant des fluororophores, nous avons montré que les capsules étaient semi-perméables avec une coupure de taille permettant l'encapsulation directe de protéines et d'enzymes de 32,7 kDa et plus, tout en permettant le transport de molécules plus petites. Les biomolécules ont été retenues dans les capsules sans dégradation et ont été réparties de manière homogène à l'intérieur des capsules. Les enzymes encapsulées survivent au séchage à l'air dans le tréhalose et ont une activité enzymatique après réhydratation. Les capsules semi-perméables ont pu communiquer avec leur environnement, ce qui nous a permis de mettre en œuvre une cascade de signalisation à deux couches en immobilisant les réactions de déplacement de brin d'ADN à l'intérieur du noyau liquide de deux populations différentes de microcapsules6. Au total, ce travail décrit le développement et la caractérisation de microcapsules semi-perméables avec une coque polymère biocompatible qui peuvent être utilisées pour l'encapsulation de différentes biomolécules pour une utilisation dans des applications diagnostiques, thérapeutiques ou de biologie synthétique.

Les dérivés de PEG étant généralement considérés comme biocompatibles, bioinertes et biodégradables7, nous avons testé différents PEG-DA de faible poids moléculaire, tels que le PEG-DA MW 700, le PEG-DA MW 575 et le PEG-DA MW 258 comme précurseurs pour la production de microcapsules. après photopolymérisation par illumination UV. Pour le PEG-DA avec MW 575 ou plus, leur miscibilité à l'eau nous a empêchés de former facilement des doubles émulsions. Leonavicène et al. ont récemment montré qu'il est possible d'obtenir un système à deux phases en combinant le PEG-DA MW 575 et le PEG-DA MW 8000 de poids moléculaire élevé dans la phase interne et de former des capsules noyau-coque en utilisant le PEG-DA comme matériau de capsule8. Cependant, nous avons envisagé une approche alternative en utilisant le PEG-DA MW 258 comme précurseur potentiel de polymère en raison de son immiscibilité à l'eau, comme cela a également été rapporté par Nam et al.5. Cette propriété du PEG-DA MW 258 nous a permis de l'utiliser comme phase intermédiaire dans les doubles émulsions et était compatible avec la génération de gouttelettes dans un dispositif PDMS (Fig. 1A). Pour former les double-émulsions, nous avons utilisé une phase continue aqueuse additionnée de 10% de PVA. La phase intermédiaire du PEG-DA 258 est complétée par un photoinitiateur (HMPP) et un tensioactif (Span80), avec l'ajout éventuel d'un solvant organique doux. Nous avons réalisé des doubles émulsions monodisperses en régime de jetting avec des débits de 2500 \(\upmu \)L/h pour la phase continue aqueuse, 200 \(\upmu \)L/h pour la phase intermédiaire PEG-DA MW 258, et 250 \(\upmu \)L/h pour la phase interne aqueuse (Fig. 1B). Fait intéressant, les doubles émulsions pourraient être générées sans nécessiter de traitement de surface du dispositif en raison de la géométrie non plane du dispositif PDMS qui empêche le mouillage du canal de collecte par la phase médiane hydrophobe.

Production de microcapsules semi-perméables dans un dispositif PDMS à géométrie 3D. (A) Représentation schématique du dispositif PDMS avec géométrie 3D. Des doubles émulsions E/H/E sont générées avec une phase intermédiaire PEG-DA 258 encapsulant un noyau aqueux interne. (B) Micrographies du fonctionnement du dispositif PDMS. (C) Image en fond clair des microcapsules obtenues après polymérisation UV de la double émulsion collectée. (D) Distribution de taille d'un lot représentatif de microcapsules polymérisées. (E) Représentation schématique de PIPS sous illumination UV. De l'acétate de butyle à 15 % (porogène) a été mélangé avec du PEG-DA 258 pour former des microcapsules semi-perméables. (F) Dans la double émulsion collectée, le FITC-dextran de haut poids moléculaire de 500 kDa et le RITC-dextran de poids moléculaire inférieur de 40 kDa sont retenus dans la phase aqueuse interne. (G) Après polymérisation UV et PIPS, des pores se forment dans l'enveloppe de la capsule et les capsules deviennent semi-perméables.

Nous avons recueilli des doubles émulsions dans une cuvette transparente aux UV pendant 15 minutes, après quoi les capsules ont été polymérisées par lots par exposition aux UV. Après polymérisation, nous avons obtenu des capsules monodisperses d'un diamètre moyen de 62 \(\upmu \)m (Fig. 1C,D). Le coefficient de variation était proche de 5 %, conformément aux résultats antérieurs utilisant des dispositifs PDMS similaires9. L'enveloppe de la capsule a été estimée à partir de l'inspection d'images au microscope entre 5 et 10 \(\upmu \)m d'épaisseur. Nos résultats confirment non seulement l'observation de Nam et al.5 selon laquelle le PEG-DA MW 258 non miscible à l'eau est une phase intermédiaire appropriée, mais ont démontré sa compatibilité avec la génération d'une double émulsion dans un dispositif PDMS qui ne nécessite aucun traitement de surface, et a abouti à la production de microcapsules poly-PEG-DA 258 monodispersées à coques minces poreuses (Fig. 1E – G).

Les microcapsules PEG-DA 258 sont semi-perméables et la taille des pores peut être ajustée en changeant le porogène. Représentation schématique des microcapsules PEG-DA 258 produites en utilisant (A) 15 % d'acétate de butyle ou (C) 15 % de 1-décanol comme porogène. Les microcapsules d'acétate de butyle à 15 % ont permis sélectivement la perméation de 10 kDa RITC-dextran tout en excluant 32,7 kDa EGFP. La plus grande taille des pores des microcapsules produites avec 15% de 1-décanol comme porogène a permis la diffusion des deux molécules fluorescentes. Les microcapsules produites à l'aide de (B) 15 % d'acétate de butyle ou (D) 15 % de porogène 1-décanol ont été immergées dans une solution contenant 10 kDa RITC-dextran et 32,7 kDa EGFP. L'évolution du signal fluorescent dans les canaux Cy3 et FITC a été observée après 5 min, 1 h et 24 h. Alors que les microcapsules produites à l'aide de 15% de 1-décanol étaient perméables aux deux molécules fluorescentes, nous avons clairement observé la perméabilité sélective des microcapsules produites à l'aide de 15% d'acétate de butyle comme porogène.

Pour produire des capsules semi-perméables, nous avons utilisé le solvant inerte doux acétate de butyle ajouté à la phase intermédiaire servant de porogène dans PIPS4,10. L'acétate de butyle a été utilisé par Kim et al.4 pour former des nanopores d'un diamètre inférieur à 30 nm dans une coquille mince composée d'un réseau réticulé de triacrylate de triméthylolpropane éthoxylé (ETPTA) et de méthacrylate de glycidyle (GMA). Pour évaluer la perméabilité des capsules semi-perméables, nous avons ajouté 500 kDa FITC-dextran et 40 kDa TMR-dextran à la phase aqueuse interne, et avons observé que près de 90 % des capsules polymérisées retenaient le 500 kDa FITC-dextran après les capsules ont été lavés abondamment par centrifugation successive dans un tampon aqueux suivi d'une incubation de 24h dans un tampon à 4 \(^{\circ }\)C (Fig. 1G). D'autre part, seulement environ 40 % des capsules ont conservé le TMR-dextran de poids moléculaire inférieur de 40 kDa. Ces résultats ont montré que certaines capsules sont semi-perméables, comme en témoignent les capsules dans lesquelles seul le fluorophore de poids moléculaire plus élevé est retenu. Même si le seuil de taille n'a pas pu être déterminé avec précision à partir de cette expérience, nous l'avons estimé bien en dessous de 500 kDa et potentiellement proche de la taille du plus petit fluorophore de 40 kDa.

Pour mieux caractériser la semi-perméabilité, nous avons préparé des capsules vides et les avons placées dans une solution de molécules fluorescentes de plus petits poids moléculaires (Fig. 2). Nous avons placé des capsules vides produites à l'aide d'un porogène à 15% d'acétate de butyle dans une solution contenant à la fois 10 kDa RITC-dextran et 32, 7 kDa EGFP (Fig. 2A, B). Nous avons observé que la plupart des capsules présentaient une augmentation relativement rapide du signal dans le canal fluorescent rouge, correspondant au poids moléculaire inférieur de 10 kDa RITC-dextran. Après 1 h d'incubation, la plupart des capsules ont montré un signal fluorescent rouge, et toutes les capsules ont affiché un signal fluorescent rouge après 24 h d'incubation. Dans le même temps, la majorité de ces capsules n'ont montré aucune augmentation de signal dans le canal fluorescent vert correspondant à l'EGFP de 32,7 kDa. En superposant le signal des deux canaux fluorescents, nous avons clairement pu voir qu'une majorité des capsules étaient semi-perméables et excluaient l'EGFP pendant au moins 24 h tout en permettant la diffusion du 10 kDa RITC-dextran dans leur intérieur. Nous avons cependant observé une certaine variabilité dans la perméabilité des capsules, certaines capsules apparaissant perméables à l'EGFP déjà après quelques minutes d'incubation, tandis que quelques capsules excluaient encore 10 kDa RITC-dextran après 1 h.

Nous avons obtenu des capsules semi-perméables avec un seuil de taille différent en utilisant le 1-décanol comme porogène. L'utilisation du 1-décanol a été rapportée par Kim et al.4 pour créer des pores plus grands dans la coque polymère ETPTA/GMA en raison d'un paramètre d'interaction différent du 1-décanol avec le polymère en formation. Ici, nous montrons que les capsules produites avec 15% de porogène 1-décanol dans du PEG-DA 258 ont également entraîné une perméabilité plus élevée que les capsules produites avec le porogène butyl-acétate (Fig. 2C, D). Nous avons observé une augmentation du signal fluorescent vert correspondant à 32,7 kDa EGFP à l'intérieur de la capsule après seulement quelques minutes d'incubation et toutes les capsules étaient fluorescentes après 24 h. De plus, toutes les capsules étaient complètement perméables à 10 kDa RITC-dextran. Pour modifier la perméabilité de la capsule, nous avons également exploré l'utilisation d'une plus petite fraction de porogène avec 10 % d'acétate de butyle. Nous observons qu'une proportion significative des capsules n'avait pas de signal fluorescent correspondant à 10 kDa RITC-dextran après 1 h d'incubation, suggérant un seuil de perméabilité plus faible (Fig. S1 supplémentaire). Nous avons également utilisé différents solvants comme porogènes tels que 15% d'octanol (Fig. S2 supplémentaire) qui ont donné des capsules de perméabilité intermédiaire entre ce qui a été observé avec 15% d'acétate de butyle ou 15% de porogène décanol. En utilisant 15% de 2-éthyl-1-hexanol (Fig. S3 supplémentaire), nous avons produit des capsules avec une perméabilité comparable à 15% d'acétate de butyle. Ces résultats démontrent qu'il est possible de modifier la perméabilité des capsules en faisant varier la teneur et la composition des porogènes, et que différents solvants sont compatibles avec notre production microfluidique de capsules semi-perméables.

Encapsulation directe des protéines à l'intérieur de capsules semi-perméables PEG-DA 258. L'EGFP a été ajouté à la phase interne aqueuse pour une encapsulation directe. (A–C) Images au microscope de doubles émulsions montrant un signal fluorescent dans le canal FITC. (D–F) Après polymérisation, le signal fluorescent était toujours présent à l'intérieur de la plupart des capsules. La variabilité de la taille des pores ou un seuil de taille proche de l'EGFP de 32,7 kDa a entraîné une certaine fuite de protéines. (G) Profil d'intensité fluorescente de la capsule indiquée dans le panneau E. Le profil fluorescent suggère une distribution homogène de l'EGFP à l'intérieur de la capsule sans adsorption de protéines sur le matériau de la coque. (H – J) Images au microscope de capsules polymérisées contenant de la streptavidine FITC après encapsulation directe. Un signal fluorescent est présent dans toutes les capsules, suggérant que la taille des pores est trop petite pour une fuite de FITC-streptavidine. (K) Profil fluorescent sur deux capsules du panneau I. Le profil suggère une distribution homogène de FITC-streptavidine à l'intérieur de la capsule sans adsorption de protéines sur le matériau de la coque.

Ensuite, nous montrons que nous pouvons encapsuler directement des protéines dans des microcapsules poly-(PEG-DA 258) semi-perméables sans adsorption sur la coque polymère ni perte de fonction. Nous avons sélectionné 15 % d'acétate de butyle comme porogène pour permettre la rétention des protéines et des enzymes à l'intérieur des capsules, tout en permettant le transport de biomolécules plus petites à travers l'enveloppe de la capsule. Nous avons encapsulé 32,7 kDa d'EGFP à l'intérieur de nos microcapsules en l'ajoutant à une concentration finale de 2 \(\upmu \)g/mL à la phase aqueuse interne. Le signal de fluorescence EGFP a été observé dans la double émulsion sans aucun signe de précipitation (Fig. 3A – C) et, une fois polymérisées, les capsules affichaient un profil fluorescent homogène sans aucun signe d'adsorption de protéines sur le matériau de la capsule (Fig. 3D – G). Nous avons également encapsulé de la streptavidine marquée au FITC de 60 kDa dans la phase interne aqueuse à une concentration finale de 50 \(\upmu \)g/mL, et le profil de signal fluorescent dans les capsules polymérisées n'a indiqué aucun signe d'adsorption de protéines sur l'enveloppe de la capsule ( Fig. 3H–K). Après incubation dans du PBS pendant 24 h, nous avons vu qu'une proportion des capsules contenant de l'EGFP ne contenait aucun signal fluorescent (Fig. 3D – F). Cette observation suggère un seuil de perméabilité proche de la taille de ces biomolécules fluorescentes. Nous nous attendons également à une certaine variabilité de la taille des pores des capsules en raison du processus de polymérisation UV par lots, au cours duquel l'intensité UV pourrait légèrement différer en fonction de la position de la capsule dans la cuvette. De plus, certaines capsules pourraient avoir été brisées ou endommagées, ce qui entraînerait la libération de leur cargaison. Avec le plus grand poids moléculaire de 60 kDa FITC-streptavidine, nous avons vu que la plupart des capsules polymérisées contenaient un signal fluorescent après les lavages aqueux, indiquant un seuil de taille inférieur à la taille de la FITC-streptavidine.

Nous avons démontré que la coque poly-PEG-DA 258 obtenue après polymérisation UV est compatible avec l'encapsulation directe de protéines. Les matériaux utilisés n'ont pas conduit à l'adsorption des protéines sur l'enveloppe de la capsule et le processus de séparation de phase induit par la polymérisation a formé des pores suffisamment petits pour retenir les protéines avec des poids moléculaires de 32,7 kDa et plus.

Encapsulation directe d'enzymes fonctionnelles dans des microcapsules PEG-DA 258 semi-perméables. Une protéine de fusion luciférase-GFP a été directement encapsulée dans des capsules semi-perméables. La protéine de fusion fluorescente permet la visualisation de l'enzyme (A) dans la double émulsion, et (B), dans les capsules polymérisées. (C) L'éconoluciférase encapsulée montre un signal fort dans un dosage bioluminescent. Encapsulation directe de \(\beta \)-galactosidase. (D,E) Des capsules contenant des enzymes ont été dispersées dans du tréhalose et séchées à l'air à 37 \(^{\circ }\)C. (F) Après réhydratation avec une solution contenant du CPRG, le substrat a été hydrolysé en rouge de chlorophénol. (G) La solution a été imagée avec une caméra couleur montée sur un microscope inversé avec \(\times \) 4 grossissement. Les capsules présentaient une couleur violette à l'intérieur, indiquant l'activité enzymatique de la \(\beta\)-galactosidase.

Après une encapsulation réussie des protéines fluorescentes, nous avons encapsulé des enzymes et effectué des tests enzymatiques avec les capsules produites. Nous avons utilisé une protéine de fusion recombinante GFP-luciférase (econoLuciférase, Biosynth), qui a permis de confirmer l'encapsulation en mesurant son signal fluorescent. Le poids moléculaire de la protéine de fusion étant supérieur à 90 kDa conduit à une rétention de l'enzyme à l'intérieur des microcapsules. En effet, nous avons vu que les capsules à double émulsion et polymérisées contenaient un signal fluorescent provenant de la protéine de fusion fluorescente écononoluciférase. Dans les deux cas, nous avons observé une distribution mouchetée du signal fluorescent qui pourrait être due à une précipitation dans la solution interne de PVA à 10 % (Fig. 4A, B). Les capsules contenant de l'éconoLuciférase ont été placées dans une solution contenant de la D-luciférine, et nous avons mesuré un signal bioluminescent de deux ordres de grandeur supérieur au signal observé pour les capsules vides (Fig. 4C). Ces résultats ont démontré qu'une enzyme active peut être encapsulée dans des microcapsules de poly-PEG-DA 258, l'enveloppe semi-perméable permettant la diffusion du substrat D-luciférine au cœur des microcapsules pour générer un signal bioluminescent.

Dans un deuxième exemple, nous avons montré que les gélules peuvent être séchées et réhydratées tout en préservant la fonction enzymatique. Nous avons encapsulé la \(\beta \)-galactosidase, une enzyme tétramérique d'un poids moléculaire de 465 kDa. Pour montrer que les capsules contenant des enzymes peuvent être séchées et conserver leur activité lors de la réhydratation, nous avons dispersé des capsules contenant de la \(\beta\)-galactosidase dans une solution de tréhalose 0,5 M et séché de petites gouttes pendant une nuit dans un incubateur à 37 \(^{\ circ }\)C résultant en pastilles de tréhalose (Fig. 4D,E). Après avoir réhydraté les pastilles séchées avec une solution de Chlorophenolred-\(\beta\)-d-galactopyranoside (CPRG), nous avons observé un changement de couleur lors de la conversion enzymatique du CPRG jaune en rouge de chlorophénol. Nous avons observé que le changement de couleur se produisait à l'emplacement des capsules et la visualisation avec un objectif 4 × a montré que l'intérieur de certaines caspules se transformait en une couleur rouge violet intense (Fig. 4F, G). Bien que les images n'aient pas été utilisées comme quantification de la concentration de rouge de chlorophénol, elles ont clairement montré que la conversion de CPRG en rouge de chlorophénol s'est produite à l'intérieur des capsules contenant la \(\beta\)-galactosidase. Ces résultats ont démontré la possibilité d'encapsulation directe d'enzymes actives dans des microcapsules semi-perméables, et nous avons en outre montré que les capsules peuvent être séchées à l'air dans une solution lyoprotectrice de tréhalose et conserver leur activité après réhydratation.

Immobilisation du réseau de réaction de déplacement de brin d'ADN dans des microcapsules semi-perméables et mise en place d'une cascade de signalisation à deux couches. (A) Représentation schématique de la cascade de signalisation à deux couches telle que développée par Joesaar et al.6 (B) Mise en œuvre de la cascade de signalisation à deux couches dans des capsules poly-PEG-DA 258. Les deux populations de capsules ont été mélangées et imagées sur une lame de comptage de cellules immédiatement après l'ajout de 50 nM de brin d'entrée (A). Une augmentation des signaux fluorescents Cy5 et Cy3 a été observée correspondant à l'activation des première et deuxième populations, respectivement. (C) Intensité médiane des particules détectées. Une augmentation du signal Cy5 a été observée correspondant à la première population de capsules activée. Après libération et diffusion du brin signal (\(Q_1\)) à la deuxième population de capsules, une augmentation du signal Cy3 a été observée correspondant à leur activation ultérieure. Les symboles plus grands correspondent à la médiane de toutes les particules détectées dans un canal fluorescent donné.

Nous avons étudié la possibilité d'encapsuler des systèmes biomoléculaires plus complexes, car cela pourrait être utilisé pour détecter et répondre à un stimulus dans des applications diagnostiques, thérapeutiques ou théranostiques. Il a été récemment démontré que des réactions de déplacement de brin d'ADN (DSD) peuvent être réalisées dans des microcompartiments de protéosomes11 en tant que modèle de communication protocellulaire et de calcul biomoléculaire distribué6. Ici, nous avons immobilisé des brins d'ADN biotinylés dans nos capsules de poly-(PEG-DA 258) contenant de la streptavidine, suivant la conception de Joesaar et al.6.

Nous avons mis en place une cascade de signalisation à deux couches en fonctionnalisant une première population de capsules avec une porte DSD de transducteur qui s'active après le déplacement du pied par un brin d'entrée d'ADNss (A), ce qui conduit à la libération d'un brin de signal (Q1) et à l'extinction d'un Fluorophore Cy5. Le brin signal (Q1) peut à son tour activer une deuxième population de capsules fonctionnalisées avec une porte DSD transducteur-amplificateur libérant un deuxième brin signal (Q2), cette fois désactivant un fluorophore Cy3. Nous avons également ajouté un brin de carburant qui agit comme un amplificateur (Fig. 5A). Les deux populations de capsules ont été mélangées et la cascade de signalisation à deux couches a été activée lors de l'ajout du brin d'entrée (A). Dans cette expérience, nous avons mélangé les deux populations de capsules, ajouté un brin d'entrée de 50 nM (A) et chargé les capsules en mouvement libre dans une chambre de comptage de cellules. Nous avons d'abord mesuré une augmentation du signal Cy5 correspondant à la première population de capsules contenant la première grille de transducteur DSD activée. Après un décalage de quelques minutes, nous avons constaté une augmentation ultérieure du signal Cy3 correspondant à la deuxième population de capsules contenant la porte DSD du transducteur-amplificateur (Fig. 5B, C). Nous avons observé une augmentation de Cy5 dans environ 10 capsules de la première population et une augmentation de Cy3 dans environ 15 capsules de la seconde population. L'activation de la cascade à deux couches pourrait être modifiée en modifiant la concentration du brin d'entrée (A). En augmentant sa concentration à 100 nM, l'activation de la première population a été fortement accélérée et il a été difficile de capturer l'augmentation du signal initial (Fig. S4 supplémentaire). D'autre part, la réduction de la concentration de (A) à 10 nM a conduit à un niveau d'activation beaucoup plus faible (Fig. S4 supplémentaire). Dans tous les cas, nous avons observé un décalage de 5 à 10 min entre l'activation de la première population et l'activation de la seconde population. Bien qu'il s'agisse d'une mise en œuvre succincte des réactions DSD compartimentées récemment développées, ces résultats ont démontré que les réactions DSD peuvent être efficacement encapsulées dans nos microcapsules semi-perméables et utilisées pour construire des systèmes biomoléculaires communicants.

Dans ce travail, nous présentons la production de microcapsules poly-PEG-DA 258 biocompatibles et semi-perméables et leur utilisation pour l'encapsulation de protéines ou de réseaux d'ADN tout en conservant la fonctionnalité. Tout d'abord, nous montrons que le PEG-DA 258 peut être utilisé comme phase médiane polymérisable pour la production de microcapsules matricées à partir d'une double émulsion eau-dans-PEG-DA 258-dans-eau. La génération d'une telle double-émulsion ne nécessite pas l'utilisation d'un dispositif capillaire en verre5, mais peut être réalisée dans un dispositif PDMS à géométrie 3D qui ne nécessite aucun traitement de surface12. La méthode relativement simple et la reproductibilité dans la fabrication et l'utilisation de dispositifs PDMS non traités pour la production de microcapsules poly-PEG-DA 258 devraient rendre cette méthode disponible pour de nombreux laboratoires ayant accès à la fabrication de base de la lithographie douce.

En ajoutant un diluant inerte à la phase intermédiaire PEG-DA 258, nous montrons que des microcapsules semi-perméables peuvent être formées par PIPS. Cette technique était auparavant utilisée dans la formation de microcapsules semi-perméables fabriquées à partir d'autres polymères à base d'acrylate tels que des mélanges d'ETPTA/GMA4 ou d'EDGMA/GMA10. Bien que la semi-perméabilité des capsules fabriquées à partir de tels polymères ait été démontrée, aucune encapsulation directe des composants biologiques n'a été obtenue, à part l'encapsulation de l'ADN plasmidique dans les microcapsules ETPTA/GMA de Niederholtmeyer et al.13. Il est intéressant de noter que l'ADN plasmidique contenu dans ces capsules pourrait encore servir de matrice d'expression protéique après immersion dans un système de traduction de transcription acellulaire. Cependant, la capsule ETPTA/GMA devait d'abord réagir avec de l'amino-PEG12-alcool pour empêcher l'adsorption de protéines sur l'enveloppe de la capsule, ce qui indique également que l'encapsulation directe de protéines ou d'enzymes aurait été exclue par l'utilisation de tels polymères.

Ici, nous confirmons l'observation précédente de Nam et al.5 selon laquelle les microcapsules de poly-PEG-DA 258 ne conduisent pas à l'adsorption de biomolécules, y compris les protéines fluorescentes ou les enzymes, permettant leur encapsulation directe à l'intérieur des microcapsules semi-perméables. De plus, les petits pores obtenus par PIPS lors de l'utilisation d'acétate de butyle comme porogène ont été estimés proches ou même inférieurs au rayon hydrodynamique du petit EGFP de 32, 7 kDa. Cela permettra l'encapsulation d'une variété de protéines, d'ARN, d'ADN ou d'autres (bio)-molécules d'intérêt tant que leur taille n'est pas inférieure à ce seuil. Nous montrons que l'encapsulation d'enzymes actives est possible et que la semi-perméabilité des capsules surmonte les défis d'une encapsulation stable sans libération de l'enzyme, tout en permettant la diffusion de réactifs et de produits dans et hors des capsules. Alternativement, nous proposons que l'encapsulation de la streptavidine puisse servir de partenaire d'immobilisation pour des molécules plus petites. De plus, l'encapsulation de billes magnétiques fonctionnalisées ou de particules de taille appropriée pourrait être utilisée dans le même but. Dans les développements futurs, cela pourrait servir à immobiliser des peptides et de petites protéines avec des étiquettes d'affinité, voire de petites molécules, qui pourraient être activées ou libérées lors de la détection d'un stimulus externe14. Ici, nous avons appliqué ce concept en immobilisant de courts brins d'ADN modifiés avec une poignée de biotine sur de la streptavidine encapsulée, qui a servi à la mise en œuvre d'une cascade de signalisation à deux couches à partir de réactions de déplacement de brin d'ADN (DSD). Alors que la mise en œuvre des réactions DSD dans les microcompartiments proposée par Joesaar et al.6 a été réalisée à l'origine dans les protéosomes, nous montrons que nos microcapsules semi-perméables sont également capables de mettre en œuvre une telle application complexe de biologie synthétique.

Ce travail est la première démonstration de l'encapsulation directe de biomolécules actives dans des capsules biocompatibles semi-perméables en poly-PEG-DA 258, mais avec certaines limitations. Alors que la méthode d'encapsulation et les paramètres sélectionnés étaient adaptés aux applications choisies, nous reconnaissons que des améliorations pourraient être apportées pour augmenter le rendement des microcapsules intactes et pour obtenir une coupure de semi-perméabilité spécifique. L'élimination efficace du porogène dans les lavages aqueux et d'autres processus en aval affectant la perméabilité des capsules peut être encore améliorée pour produire des capsules plus homogènes. Comme le contrôle de l'éclairage UV initiant le processus de polymérisation est essentiel pour le PIPS et génère la perméabilité souhaitée, les développements futurs pourraient utiliser la polymérisation en ligne pour produire des capsules afin d'assurer un éclairage uniforme de chaque gouttelette à double émulsion. Enfin, l'adaptation de la densité entre les différentes phases, la modification de l'épaisseur de la coque, ainsi que l'exploration de différentes compositions de porogènes, de tensioactifs et de photoinitiateurs seront nécessaires pour produire des capsules aux propriétés adaptées pour d'autres applications spécifiques.

En conclusion, nous avons démontré l'encapsulation en une étape d'une variété de biomolécules dans des microcapsules poly-PEG-DA 258 modélisées à partir de doubles émulsions. Des molécules fluorescentes, des protéines, des enzymes et des brins d'ADN à activité biologique peuvent être chargés au cœur des capsules semi-perméables biocompatibles. Cela ouvre les portes à la construction de cellules artificielles biomoléculaires multi-composants complexes et robustes avec des applications diagnostiques, thérapeutiques et de biologie synthétique.

Les ensembles de données utilisés et/ou analysés au cours de la présente étude sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

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Les auteurs remercient Rohan Thakur pour sa contribution à la mise en place des pousse-seringues et pour sa contribution au développement initial de la plateforme. Ils remercient le professeur Esther Amstad, Jui-Chia Chang, le Dr Gianluca Etienne et le laboratoire SMaL de l'EPFL pour nous avoir fourni le photomasque du dispositif microfluidique et pour leur aide dans les expériences préliminaires. GM a été soutenu par le Programme MD-PhD du Fonds National Suisse de la Recherche Scientifique (FNS, 323530\(\_\)171144) et par un SNF NRP (Programme National de Recherche) 78 Covid-19 Grant 198412 (au SJM). Ce travail a été publié dans le cadre de la thèse EPFL MD-PhD n° 838516.

School of Engineering, Institute of Bioengineering, École Polytechnique Fédérale de Lausanne, Lausanne, Switzerland

Gregory Michielin & Sebastian J. Maerkl

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Recherche conçue par GM et SJM ; GM a effectué des recherches; GM et SJM ont analysé les résultats et les données ; GM et SJM ont rédigé le manuscrit.

Correspondance à Sebastian J. Maerkl.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Michielin, G., Maerkl, SJ Encapsulation directe de biomolécules dans des microcapsules semi-perméables produites avec des doubles émulsions. Sci Rep 12, 21391 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-25895-8

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Reçu : 21 septembre 2022

Accepté : 06 décembre 2022

Publié: 10 décembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-25895-8

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