Études moléculaires et in vivo d'un glutamate

Nature Communications volume 13, Numéro d'article : 4446 (2022) Citer cet article

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La digestion du gluten génère des peptides toxiques, parmi lesquels un 33-mer hautement immunogène riche en proline de l'α-gliadine de blé, qui déclenchent la maladie coeliaque. La néprosine de la sarracénie pourpre est une prolyle endopeptidase rapportée. Ici, nous produisons de la néprosine recombinante et ses mutants, et constatons que la néprosine pleine longueur est un zymogène, qui est auto-activé au pH gastrique par la libération d'un pro-domaine tout-β via un mécanisme de commutation de pH comportant un bouchon de lysine . Le domaine catalytique est un sandwich β atypique à 7 + 8 brins avec une fente de site actif étendue contenant une paire sans précédent de glutamates catalytiques. La néprosine dégrade efficacement à la fois la gliadine et le 33-mer in vitro dans des conditions gastriques et est inactivée de manière réversible à pH > 5. l'intestin grêle des souris jusqu'à 90 %. La néprosine fonde donc une famille d'endopeptidases glutamatergiques eucaryotes qui remplit les conditions requises pour une glutase thérapeutique.

La maladie coeliaque (CoD) est une entéropathie auto-immune chronique qui affecte les personnes présentant une sensibilisation génétique et environnementale au gluten alimentaire, un groupe de protéines de stockage de la prolamine des céréales riches en proline et en glutamine1,2. Les prolamines qui déclenchent le CoD comprennent la gliadine et la gluténine dans le blé, l'hordéine dans l'orge et la sécaline dans le seigle. Des lésions intestinales peuvent être infligées par aussi peu qu'environ 10 mg de gluten alimentaire par jour3, soit <0,1 % de la quantité trouvée dans un régime occidental typique2. Le CoD est un fardeau mondial pour la santé dans toutes les tranches d'âge, avec une prévalence sérologique mondiale de 1,4 %4 qui augmente de 7,5 % chaque année5. La maladie est causée par des peptides de gluten partiellement dégradés, dont un fragment de 33 résidus d'α-gliadine de blé (33-mer) qui est immunogéniquement le plus pertinent2,6. Ces peptides résistent à un clivage supplémentaire par les peptidases membranaires gastriques, pancréatiques et intestinales de la bordure en brosse en raison de leur teneur élevée en proline (13 dans le 33-mère). Chez les cœliaques, ils traversent l'épithélium muqueux de l'intestin grêle, où les résidus de glutamine sont désamidées par la transglutaminase tissulaire. Cela améliore l'affinité des peptides pour les allèles DQ2.5/DQ2.2 et DQ8 du récepteur de l'antigène leucocytaire humain (HLA), qui sont nécessaires au développement de CoD2. La liaison au récepteur déclenche une réponse auto-immune pro-inflammatoire sévère médiée par les cellules T, avec des effets intestinaux comprenant une lymphocytose intraépithéliale, une hyperplasie des cryptes, une atrophie des villosités de l'intestin grêle et une inflammation des muqueuses2. Ceux-ci entraînent une malabsorption chronique des nutriments, des diarrhées, des vomissements, des ballonnements, des douleurs abdominales et des lymphomes intestinaux. Les manifestations extra-intestinales comprennent la puberté retardée, l'ostéoporose, la neuropathie axonale et l'ataxie cérébelleuse7, qui réduisent l'espérance de vie des coeliaques. Il n'y a pas de traitement pour le CoD, les patients doivent donc suivre un régime sans gluten strict à vie, qui restaure l'architecture normale des villosités intestinales2. Cependant, les régimes sans gluten ne fournissent pas une alimentation équilibrée7, et de nombreux cœliaques souffrent de symptômes intestinaux même en respectant ces restrictions alimentaires8,9. De plus, le gluten est présent dans la plupart des aliments transformés et des médicaments, ce qui rend difficile l'observance diététique dans les sociétés occidentales2. Cela a créé une demande pour des thérapies CoD efficaces.

Une approche prometteuse est le développement d'endopeptidases qui clivent les peptides toxiques et agiraient ainsi comme de véritables glutases pour l'enzymothérapie orale10,11,12, rappelant les comprimés de lactase pour l'intolérance au lactose13. Une telle approche bénéficierait également aux patients souffrant de sensibilité au gluten non cœliaque, dont la prévalence mondiale peut atteindre 13 %, et du syndrome du côlon irritable, avec une prévalence <0,5 %8,14,15. Une gluténase candidate doit remplir certains critères pour une application clinique. Premièrement, il doit fonctionner dans l'estomac pendant la digestion, avant que le bolus gastrique ne passe dans le duodénum et déclenche la réponse auto-immune, et doit donc rester stable et actif dans l'environnement gastrique acide (pH ~ 2,5) ainsi que résister à la pepsine gastrique. Deuxièmement, une dose raisonnable devrait digérer efficacement la gliadine et le 33-mer lorsqu'ils sont combinés avec de la pepsine dans des conditions gastriques, ce qui nécessite le traitement de grandes quantités de protéines alimentaires. Troisièmement, il ne devrait pas nuire aux structures intestinales ou inhiber l'absorption des nutriments, et devrait donc idéalement être inactif au pH postprandial légèrement acide du duodénum16.

Le potentiel thérapeutique de plusieurs glutaminyl et prolyl endopeptidases (PEP) a été évalué, représentant diverses classes catalytiques et diverses sources, notamment des bactéries, des champignons, des insectes et des céréales en germination7,10,11,12. Il s'agit notamment d'un PEP à sérine d'Aspergillus niger10,17 ; STAN1, une combinaison d'aspartate aspergillopepsine d'A. niger et de sérine dipeptidyl-peptidase IV18 d'Aspergillus oryzae ; latiglutenase, une combinaison d'une cystéine peptidase spécifique de la glutamine provenant de l'orge et d'une sérine prolyl oligopeptidase spécifique modifiée provenant de Sphingomonas capsulata19 ; des endopeptidases à sérine de type subtilisine provenant des colonisateurs oraux naturels Rothia aeria et Rothia mucilaginosa11 ; et les enzymes synthétiques KumaMax et Kuma062/TAK-062, développées par la refonte informatique de la kumamolysine, une sérine endopeptidase de la bactérie Alicyclobacillus sendaiensis20. Cependant, aucun de ces candidats ne remplit toutes les conditions ci-dessus. Les précurseurs actuels ne montrent pas une activité élevée dans des conditions de pH gastrique et/ou nécessitent des doses très élevées ou des modifications protectrices, telles que la PEGylation ou la microencapsulation. En conséquence, les essais cliniques n'ont pas encore abouti à une rémission clinique significative chez les cœliaques et n'ont pas démontré la capacité de ces enzymes à remplacer un régime sans gluten12. Pire, de nombreuses préparations dites enzymatiques actuellement vendues sans ordonnance comme compléments alimentaires CoD n'inactivent pas les peptides de gluten toxiques et représentent donc un danger pour les cœliaques21.

La néprosine est une endopeptidase à 380 résidus de classe et de mécanisme inconnus, actuellement attribuée à la famille U74 dans la base de données MEROPS (www.ebi.ac.uk/merops22). Il s'agit d'une PEP qui a été découverte dans le liquide digestif de la plante carnivore Nepenthes × ventrata, qui piège les proies dans son pichet23,24,25,26. L'enzyme pourrait jouer un rôle dans le métabolisme des protéines lors de la digestion et/ou de la défense des proies23. En combinaison avec d'autres peptidases du liquide digestif, il a été identifié comme faisant partie d'une préparation potentielle de gluténase24. La néprosine purifiée est également considérée comme un réactif utile pour la protéomique25,26.

Ici, nous établissons un système de production recombinant humain pour produire des rendements élevés de néprosine. Nous déterminons son mécanisme d'activation in vitro ainsi que sa stabilité thermique, son profil de pH, ses activités protéolytiques et peptidolytiques générales et sa sensibilité à un panel d'inhibiteurs de peptidase. Nous testons également le clivage de la gliadine et du 33-mer in vitro pour évaluer la capacité de la néprosine à agir comme une gluténase solo. De plus, nous évaluons l'effet de la néprosine recombinante sur le traitement de la gliadine chez la souris. Enfin, nous rapportons la structure cristalline du zymogène néprosine et sa forme mature dans des complexes imitant le produit. Ces données révèlent le mécanisme de latence, les architectures globale et de site actif, le mécanisme catalytique et la classe de peptidase, qui ont été validés par une cohorte de mutants.

Des études antérieures sur la néprosine utilisaient principalement l'enzyme purifiée à partir de fluide de plante carnivore car l'expression hétérologue dans Escherichia coli ne produisait qu'une enzyme partiellement impure avec un rendement modeste24,25. Nous n'avons pas pu reproduire cette approche, nous avons donc développé un système basé sur des cellules humaines, en supposant qu'un traitement post-traductionnel eucaryote est nécessaire. Cela a donné ~ 10 mg / L de protéine pleine longueur bien repliée pure avec une étiquette hexahistidine (His6) C-terminale (41 kDa) ou ~ 8 mg / L avec une étiquette à double streptavidine (Strep) (43 kDa) ( Fig. 1a, b). La protéine était correctement repliée et est restée stable pendant plusieurs semaines à 4 ° C dans un tampon neutre, mais manquait d'activité protéolytique, ce que nous avons attribué au fait que la protéine pleine longueur était le zymogène pro-néprosine. En effet, il a facilement subi une maturation autolytique au niveau de la liaison P128-S129 (numérotation des résidus de la néprosine en exposant ; UniProt ID C0HLV2) au fil du temps lorsqu'il est incubé dans un tampon très acide, donnant le domaine catalytique de la néprosine (CD) et le pro-domaine excisé (PD ) (Fig. 1e). Cette dernière a finalement été dégradée et la pro-néprosine et la néprosine ont migré sous forme de monomères lorsqu'elles ont été vérifiées par chromatographie d'exclusion de taille (SEC) calibrée (Fig. 1d).

a Purification de la pro-néprosine de type sauvage (WT) par chromatographie d'affinité His6- ou (b) Strep-tag. Les fractions d'écoulement (FT), de lavage (W) et d'élution (E1 – E3) ont été analysées par SDS-PAGE et coloration de Coomassie, aux côtés des marqueurs de masse moléculaire (piste M). Les panels sont représentatifs de trois expériences indépendantes. c Mutants de la pro-néprosine (K118A, H134A, Y136A, Q173A, W175A, E188A, E188Q, Y214A, E297Q et E297A) après purification par affinité His6-tag par rapport aux formes WT de (a) et (b). Figure représentative de deux expériences indépendantes. d Profils de chromatographie d'exclusion de taille de la pro-néprosine avec étiquette His6 (magenta), de la néprosine avec étiquette Strep (vert) et de la néprosine avec étiquette His6 (bleu) séparés sur une colonne Superdex 75 10/300 GL. Chaque courbe est étiquetée avec le volume d'élution en mL, représentant les monomères dans tous les cas. e Maturation autolytique de la pro-néprosine dans le temps à 37 °C dans un tampon acide. Figure représentative de deux expériences indépendantes. f Activation des variants de pro-néprosine (lignes Z) par autolyse acide (lignes A) ou en trans en ajoutant de la néprosine étiquetée Strep (lignes S). Le mutant K118A (troisième panneau) a été obtenu sous forme de protéine pré-activée après purification par affinité, révélant des bandes séparées de PD et de protéines matures (piste Z), qui sont devenues entièrement activées par incubation dans un tampon acide (piste A). Figure représentative de deux expériences indépendantes. Pour les panneaux distincts de cette figure, les données sources pertinentes sont fournies sous forme de fichier de données sources si elles sont adéquates.

La fluorimétrie différentielle à balayage utilisant l'approche thermofluor27 a révélé une température de transition intermédiaire (Tm) de 68 ° C pour l'enzyme mature (Fig. 2a), ce qui est remarquable pour une peptidase qui fonctionne dans une plage de température ambiante et rappelle davantage les enzymes hyperthermophiles28 . De plus, la Tm du zymogène était supérieure de 9 ° C (Fig. 2a), ce qui suggère que la PD favorise la stabilité et, éventuellement, le repliement correct de la protéine de pleine longueur, comme indiqué pour d'autres zymogènes29. Cela a été soutenu par notre incapacité à exprimer la néprosine mature (sans le PD) en utilisant le même système d'expression. Enfin, des études au thermofluor en présence d'un agent réducteur ont révélé un processus de dépliement avec deux transitions, la première se produisant à 42–44 ° C (Fig. 2b). Cela indique l'existence de liaisons disulfure qui stabilisent la protéine, comme discuté plus en détail ci-dessous.

a Fluorimétrie différentielle à balayage montrant des courbes en double de la variation de fluorescence en fonction de la température lors de la dénaturation thermique de la néprosine (rouge foncé) et de la pro-néprosine (vert). Les températures médianes de transition en médaillon (Tm) sont les points d'inflexion moyens des deux courbes respectives. b Identique à (a), illustrant l'effet du TCEP en tant qu'agent réducteur à 5 mM (rouge) et 10 mM (vert) par rapport à la pro-néprosine non traitée (bleu). c L'activité dépendante du pH de la pepsine (rouge), de la trypsine (verte) et de la néprosine (bleue) sur un substrat BSA fluorescent. Pour la néprosine, les données sont des moyennes ± SD (n = 3 expériences indépendantes). Les valeurs de trypsine et de pepsine ont été mesurées une fois. d, e Cinétique du clivage médié par la néprosine des peptides fluorogènes (d) FS6 (néprosine 100 nM) et (e) FS6-QPQL (néprosine 25 nM). Les encarts montrent les valeurs Vmax, kcat, KM et kcat/KM correspondantes. f Activité peptidolytique de la néprosine de type sauvage (WT) et des mutants sur le peptide fluorogène FS6-QPQL. Signification statistique déterminée par le test t de Student bilatéral (*p < 0,1 ; **p < 0,05 ; ***p < 0,001). Pour les sept barres avec ***, les valeurs de p étaient, de gauche à droite, 0,0052, 0,0050, 0,0036, 0,0036, 0,0029, 0,0033 et 0,0034. g Logo illustrant la préférence de substrat de la néprosine basée sur la réanalyse des données déposées25. h Effet des molécules ou mélanges testés (1) 1,10-phénathroline, (2) AEBSF, (3) phosphoramidon, (4) marimastat, (5) cOmplete, (6) BGP, (7) captopril, (8) DAN, (9) BEOPC, (10) AMP, (11) pepstatine A et (12) EPNP par rapport au contrôle WT (C). Seuls les deux derniers composés obtiennent une inhibition significative. Signification statistique déterminée par le test t de Student bilatéral (*p < 0,1 ; **p < 0,05 ; ***p < 0,001). Pour les deux barres avec ** et *, les valeurs de p étaient respectivement de 0,0215 et 0,0698. i Tracé de l'activité inhibitrice de la pepstatine A (à gauche) et de l'EPNP (à droite) montrant les concentrations du testeur avec les valeurs CI50 dérivées. Pour les panels d–f, h et i, les données sont des moyennes ± SD (n = 3 expériences indépendantes) et les données sources pertinentes sont fournies sous forme de fichier Source Data si elles sont adéquates.

Nous avons étudié l'effet du pH sur le clivage de l'albumine sérique bovine fluorescente (BSA) par la néprosine, en utilisant la pepsine gastrique, une aspartate peptidase, et la trypsine pancréatique, une sérine peptidase, à titre de comparaison (Fig. 2c). Le pH optimum de la néprosine était de 3, proche de celui de la pepsine gastrique (pH < 2). En revanche, le pH optimal de la trypsine était de 8, une valeur à laquelle la néprosine et la pepsine étaient complètement inactives. La pepsine était inhibée de manière irréversible à pH neutre, comme indiqué précédemment30, tandis que la néprosine était activée et inactivée de manière réversible en basculant entre pH 2,5 et 9,0. De plus, la néprosine n'a pas été affectée par la congélation ou la lyophilisation à pH 7,5 pour le stockage, récupérant ainsi sa pleine activité après décongélation ou remise en suspension dans un tampon acide, respectivement. Enfin, la néprosine était insensible au clivage par la pepsine à pH acide. Ce profil d'activité, d'efficacité, de stabilité et de robustesse était donc cohérent avec une enzyme digestive qui doit agir sur des échelles de temps prolongées dans des conditions variables, précisément l'environnement naturel dans les cruches des plantes carnivores31.

Pour mieux comprendre la spécificité du substrat de la néprosine et pour guider nos tests de clivage, nous avons réanalysé les données protéomiques publiées basées principalement sur du matériel purifié, qui avait identifié l'enzyme comme une PEP25 authentique. Nous avons trouvé 3001 sites de clivage uniques couvrant P6 – P6 '(nomenclature de substrat et de sous-site de site actif basée sur32,33), dont 1863 (62%) comportaient un résidu de proline dans P1 (Fig. 2g). La proline est également enrichie du double de son abondance naturelle à P2 et P3′, mais fortement défavorisée à P1′ et P2′. Le glutamate et la méthionine ont été enrichis trois fois à P2 ', l'alanine a été facilement acceptée tout au long de P6 – P6 ' et la glycine a été significativement défavorisée à P1 – P3 '. Ces données ont révélé une forte préférence pour les substrats contenant de la proline en P1 et que des positions spécifiques au sein de P6 – P6 'étaient inadaptées pour certains acides aminés (Fig. 2g).

Nous avons étudié la capacité de la néprosine à digérer la gliadine en présence et en l'absence de pepsine par SDS-PAGE et turbidimétrie, par rapport à la pepsine seule (Fig. 3a, b). Les deux enzymes ont efficacement dégradé la gliadine séparément à des concentrations inférieures à ~ 5 μM, le seuil physiologique de la pepsine34, mais des résultats optimaux ont été obtenus lorsque les deux enzymes ont été combinées. Remarquablement, la concentration optimale de néprosine était similaire à celle de la pepsine gastrique et des ordres de grandeur inférieurs à ceux requis pour les candidats gluténase actuels. La zymographie a montré que la néprosine dégradait la gliadine et la gélatine, également une protéine alimentaire, avec une efficacité similaire (Fig. 3d, e).

une analyse SDS-PAGE de la gliadine exposée à des concentrations croissantes de pepsine (à gauche), de néprosine (au centre) ou de néprosine plus pepsine (à droite). Figure représentative de deux expériences indépendantes. b Courbes illustrant le clivage de la gliadine comme dans (a) au fil du temps mesuré par turbidimétrie. c Spectres de masse, de haut en bas, du peptide 33-mer (3912 Da) ; le peptide 33-mer après incubation avec 0,5 µM de néprosine pendant 0 min, 20 min et une nuit ; néprosine seule; et le peptide 33-mer après une nuit d'incubation avec de la pepsine 10 μM, ce qui laisse le peptide intact. d Zymogramme de la gliadine illustrant l'activité de la néprosine (voie de gauche) et de l'enzyme mature résultant de l'auto-activation de la pro-néprosine (voie de droite). e Identique à (d) mais montrant la zymographie sur gélatine. f Séquence du 33-mère et étendue des six épitopes se liant à HLA-DQ2.5 qui se chevauchent, comme indiqué par les doubles flèches rouges7. Les glutamines sensibles à la désamidation par la transglutaminase sont représentées dans des cercles violets11. Le peptide correspond au segment L76-F108 de l'α-gliadine (UniProt ID P18573). g Le clivage du peptide 33-mer par la néprosine au cours du temps se déroule selon deux voies (haut et bas). Pour les panneaux distincts de cette figure, les données sources pertinentes sont fournies sous forme de fichier de données sources si elles sont adéquates.

Ensuite, nous avons étudié le clivage du 33-mer, qui comprend trois résidus de glutamine qui sont désamidés par la transglutaminase et six épitopes de cellules T immunogènes HLA-DQ2.5 se chevauchant6, 11, 35, par spectrométrie de masse (Fig. 3f). Nous avons constaté que le peptide à 250 μM était efficacement dégradé par la néprosine 0, 5 μM, un rapport de 500: 1, après 20 minutes à pH 3 (Fig. 3c). Aucun produit de clivage autolytique n'a été détecté même après une nuit d'incubation, ce qui a confirmé la stabilité de l'enzyme mature dans des conditions acides. En revanche, la pepsine n'a pas réussi à cliver le peptide même après une nuit d'incubation à une concentration 20 fois plus élevée que la néprosine, ce qui a confirmé la résistance du 33-mère aux peptidases digestives. L'analyse des fragments de clivage peptidique générés par la néprosine a révélé deux produits finaux : Q–L–P–Y–P–Q–P (843 Da) et L–Q–L–Q–P–F–P–Q–P ( 1068 Da). En surveillant la réaction au fil du temps (Fig. 3g), nous avons constaté que le clivage ne se produisait qu'immédiatement en aval de cinq résidus de proline spécifiques parmi les 13 présents dans le 33-mer, de préférence à P – Q – P * Q – L – P et toujours avec P-Q-P aux sous-sites P1-P3, ce qui qualifie la spécificité simple pour la proline à P1 déduite de la protéomique indiscriminée et est conforme à la défavorisation des grands résidus hydrophobes (leucine, phénylalanine et tyrosine) dans P2 comme discuté ci-dessus25. Dans l'ensemble, nos résultats démontrent que le 33-mer est dégradé sur plusieurs sites présentant le motif Q–P*Q–L. Remarquablement, deux dipeptides P – Q sont également trouvés dans la BSA, ainsi que cinq sites P – E également favorisés (voir ci-dessus), ce qui explique pourquoi l'albumine est un substrat approprié pour la néprosine à faible pH.

Enfin, nous avons testé le clivage d'une cohorte de peptides fluorogènes. Nous avons découvert que le peptide FS6 contenant une liaison P–L (Mca–K–P–L–G–L–Dpa–A–R–NH2), qui est un substrat des métalloprotéinases matricielles et des adamalysines36, était clivé avec une efficacité modeste selon analyse cinétique (kcat/KM = 765 M−1s−1 ; Fig. 2d). En revanche, la variante peptidique FS6-QPQL, repensée pour inclure le site de clivage de la néprosine du 33-mer (Mca-Q-P-Q-L-Dpa-A-R-NH2), a été clivée 30 fois plus efficacement, principalement en raison de l'augmentation de kcat (kcat/KM = 23 880 M−1s−1 ; Fig. 2e). En conséquence, la néprosine peut être définie comme un PEP avec une spécificité plus contrainte que PX qui dégrade efficacement le 33-mer dans des conditions de type gastrique.

Compte tenu de la classe catalytique inconnue de l'enzyme, nous avons ensuite testé un panel d'inhibiteurs de peptidase pour leur capacité à bloquer le clivage FS6-QPQL par la néprosine (Fig. 2h). Nous avons également suivi une approche récemment appliquée pour trouver des inhibiteurs de la pyrroline-5-carboxylate réductase37, dont le produit est la proline, et testé une série de composés contenant/imitant la proline. Nous avons constaté que seuls la pepstatine A et le 2-[(4-nitrophénoxy)méthyl]oxirane (EPNP) inhibaient faiblement mais significativement la néprosine (Fig. 2h), avec des valeurs de concentration inhibitrice semi-maximale (IC50) de 140 et 480 μM, respectivement ( Fig. 2i). Étant donné que la pepstatine et les époxydes de type EPNP sont des inhibiteurs des endopeptidases aspartates de type pepsine, qui ne partagent aucune similitude de séquence avec la néprosine, cela indique un type de peptidase inattendu et un mécanisme de catalyse pour la néprosine.

Pour étudier l'activité de la néprosine in vivo, les souris ont reçu un bolus de gliadine 5 min après avoir reçu soit le zymogène à un rapport de masse très faible (1: 500 w/w) soit le véhicule. Après 2,5 h, nous avons récolté le contenu de trois segments du tractus gastro-intestinal supérieur et mesuré la concentration du 33-mer par dosage immuno-enzymatique (Fig. 4). Le peptide était sensiblement moins abondant dans tous les segments des animaux traités (61-91 %) et de 71 % globalement. Le zymogène inactif est donc activé dès son arrivée dans l'estomac et contribue efficacement à la dégradation de la gliadine (et notamment du 33-mer) in vivo tout en restant résistant aux enzymes digestives physiologiques. Cela se produit à des concentrations bien inférieures à celles des gluténases candidates, et sans stratégies protectrices telles que la PEGylation ou la microencapsulation. Ces résultats sont cohérents avec une étude précédente rapportant que des souris NOD/DQ8 sensibilisées présentaient une diminution significative des marqueurs inflammatoires lorsqu'elles étaient nourries avec de la gliadine pré-digérée avec de la pepsine et du liquide de pichet Nepenthes, qui comprenait entre autres composants la néprosine et la népenthésine24.

Quantité de 33-mer (μg) dans le contenu total de l'estomac (S), de l'intestin grêle proximal (pSI) et de l'intestin grêle distal (dSI) de souris recevant le zymogène de néprosine (N) ou le véhicule (V) avant un bolus de gliadine. Les résultats sont des moyennes ± SEM (n = 8 animaux par groupe). La signification statistique a été déterminée par un test F unilatéral (*p < 0,05, N vs B). Les valeurs p étaient de 0,048 (S), 0,049 (pSI), 0,026 (dSI) et 0,021 (Total). Les données source pertinentes sont fournies sous forme de fichier de données source.

Nous avons cristallisé la pro-néprosine dans un groupe d'espace orthorhombique (Fig. 5a et Tableau supplémentaire 1) et avons constaté que le polypeptide était clivé au site de maturation physiologique (P128 – S129). Les cristaux contenaient donc le complexe zymogène du PD clivé et du CD (Fig. 5a). Nous avons résolu la structure par diffraction anormale à une seule longueur d'onde, en collectant des données à la longueur d'onde du bord d'absorption du lutétium LIII à partir d'un cristal imbibé de Lu-Xo440 (Fig. 5b). Ce trempage a entraîné une variation significative de l'un des axes des cellules cristallines par rapport aux cristaux natifs tout en conservant une bonne diffraction des rayons X (tableau supplémentaire 1). Le modèle raffiné final du complexe dérivé a été utilisé pour résoudre la structure native de la pro-néprosine par remplacement moléculaire. De plus, la néprosine mature a produit deux formes cristallines monocliniques différentes, I et II (Fig. 5a et Tableau supplémentaire 1), dont les structures ont également été résolues par remplacement moléculaire.

a Les cristaux orthorhombiques de pro-néprosine (panneau de gauche) contenaient un complexe du PD clivé (p) et du CD (e) (panneau central gauche). Les cristaux d'enzymes matures étaient monocliniques (panneau central droit, forme cristalline I; panneau de droite, forme cristalline II). L'expérience du panel centre-gauche a été réalisée une fois. b La structure de la pro-néprosine a été résolue à l'aide d'un dérivé du lutétium. Sur un site (panneau de gauche), le cation Lu3 + (sphère verte) n'était pas coordonné par deux oxygènes carboxylates plus cinq atomes d'azote de l'échafaudage organique et les oxygènes carboxylates du résidu protéique E89 à des distances allant de 2, 40 à 2, 65 Å. Carte de Fourier finale de type (2mFobs-DFcalc) de la dérivée contournée à 1,3 σ (panneau de droite). c Tracé de type ruban de la pro-néprosine en perspective frontale (panneau de gauche) et latérale (panneau de droite). Le PD est de l'or avec des hélices magenta. L'enzyme mature est montrée chez le saumon. Les segments désordonnés/clivés sont indiqués par des lignes pointillées grises. Les deux sites de glycosylation à N145 et N152, les sept cystéines, A60, et les deux glutamates catalytiques (E188 et E297) sont représentés pour leurs chaînes latérales et marqués. La carte de Fourier finale autour des deux chaînes de glycanes est représentée à 0,6 σ. d Topologie de la pro-néprosine avec des brins sous forme de flèches (marquées β1–β22) et les deux courtes hélices (α1 et α2) sous forme de bâtonnets magenta. Les résidus terminaux de chaque élément de structure secondaire sont indiqués. Le PD a des brins jaunes et des hélices magenta, la feuille avant de la fraction enzymatique mature est en orange et la feuille arrière est en brun. Les sept cystéines sont en outre indiquées en vert, les glycanes sont représentés par des losanges verts. Les glutamates catalytiques sont marqués à titre de référence. e La rangée du haut montre la vue de face de la pro-néprosine comme dans (c) (à gauche) et la vue de dos (à droite), toutes deux représentant la PD sous forme de ruban jaune et la surface coulombienne du CD (rouge, -10 kcal/mol ·e ; bleu, +10 kcal/mol·e) calculé avec Chimera85. Le pi calculé du composant enzymatique mature est de 4,3. La rangée du bas montre la même chose sauf qu'ici le PD est montré pour sa surface coulombienne (pI = 9,5) et le CD comme ruban de saumon.

La pro-néprosine est une molécule oblongue compacte de ~ 55 × ~ 45 × ~ 40 Å (Fig. 5c). Le PD N-terminal (R25-P128) est défini dans la carte de Fourier finale à partir de A29 et comporte une partie globulaire (A29-G112) suivie d'un lieur (L113-P128) vers le CD en aval (S129-Q380). Le segment (N122-N131), qui comprend le site de maturation clivé, est flexible. Le PD présente une feuille β antiparallèle à trois brins dans laquelle le brin central est coupé en deux par l'insertion du brin le plus à gauche (Fig. 5c, d). Les deux brins droits sont reliés par un long segment sur le dessus, qui comprend deux courtes hélices α, une liaison disulfure (C52-C98) et un segment désordonné de 10 résidus (Y77-N86) à l'arrière de la molécule. Ce dernier résulte probablement de la chaîne glycane saillante attachée à N152 dans un brin arrière du CD (Fig. 5c). Un deuxième glycane est attaché à N145 à partir d'une boucle croisée au-dessus du CD. Au-delà du dernier brin du PD, la chaîne subit un virage à 90 ° et pénètre dans le lieur PD / CD, qui s'étend en conformation étendue le long de la surface avant du CD.

De manière atypique pour les peptidases, qui sont généralement des protéines α/β41, la CD est un sandwich β antiparallèle, avec une feuille avant fortement bouclée à sept brins et une feuille arrière à huit brins, qui fournit un échafaudage pour la première (Fig. 5c, d). Les deux feuilles sont interconnectées par neuf boucles croisées, y compris une longue épingle à cheveux β12β13, et deux autres liaisons disulfure (C219 – C224 et C358 – C379) de chaque côté du sandwich (Fig. 5d). Tous ces éléments contribuent à une structure compacte et robuste, ce qui explique la remarquable stabilité du pH de la néprosine et sa capacité à résister à la digestion par la pepsine. En revanche, les liaisons disulfure ne sont pas profondément enfouies dans la structure, ce qui explique sa sensibilité aux agents réducteurs. La structure de la forme cristalline I de la néprosine mature (tableau supplémentaire 1) s'est avérée pratiquement identique à la partie équivalente du zymogène, avec un écart quadratique moyen (RMSD) de 0, 62 Å. La seule différence significative a été rencontrée au niveau de N232-Y233, qui est replié vers l'extérieur dans le zymogène pour accueillir I103 au début du brin le plus à droite du PD. La forme cristalline II, à son tour, était pratiquement impossible à distinguer de la forme cristalline I (core RMSD = 0,66 Å) à l'exception de la pointe de la boucle Lβ21β22, qui était espacée de 3,8 Å, et de l'étiquette C-terminale, qui a été réorienté en raison de cristal emballage. Ainsi, le composant enzymatique mature est essentiellement préformé dans le zymogène comme on le voit dans la plupart des peptidases, à l'exception notable des sérine peptidases de type chymotrypsine42,43,44.

Nous avons émis l'hypothèse que la fente du site actif serait délimitée par le lieur PD (Fig. 6a) comme on le trouve dans d'autres zymogènes42,44. De plus, dans les structures des formes cristallines de néprosine matures I et II, le segment C-terminal, qui couvrait un tripeptide alanine-isoleucine-alanine suivi de l'étiquette His6, courait le long de la surface d'un compagnon de symétrie, imitant ainsi un produit complexe . Les deux formes cristallines étaient monocliniques mais avec des constantes cellulaires différentes (tableau supplémentaire 1), ce qui entraînait un tassement cristallin variable. Même ainsi, l'étiquette C-terminale pénètre dans la fente de la même manière dans les deux arrangements cristallographiques, mais est décalée de trois positions, de sorte que H404 – H409 de la forme cristalline I chevauche A401 – H406 de la forme cristalline II (Fig. 6b, c) . En conséquence, la néprosine posséderait une fente étendue du site actif traversant la face concave de la feuille, qui est oblique par rapport à la direction des brins β de la feuille avant d'environ 55 ° (Fig. 6a – c).

a Gros plan de la Fig. 5c représentant le segment final (L113-P121) du PD défini dans la carte de Fourier finale comme un modèle de bâton avec des carbones jaunes et des numéros de résidus noirs traversant la fente du site actif. Les résidus probables P1 et P1′–P3′ sont marqués. De plus, des résidus sélectionnés du site actif sont représentés pour leurs chaînes latérales avec des carbones en tan et numérotés en bleu clair. Deux résidus de solvant potentiellement pertinents pour la catalyse sont représentés par des sphères vertes. L'encart fournit une vue rapprochée légèrement tournée pour mettre en évidence l'interaction (lignes magenta) de K118 avec E188, Q173 et une molécule de solvant. b Identique à (a) représentant le complexe produit de la néprosine mature (forme cristalline I), avec la queue C-terminale d'un compagnon de symétrie couvrant A403 et les résidus His6-tag (H404-H409) comme un modèle de bâton avec des carbones en cyan avec les sous-sites de substrat P6–P1. Une molécule de solvant potentiellement pertinente pour la catalyse (sphère verte) relie E297 et E188 (bâtonnets magenta). c Identique à (b) pour la forme cristalline II. La queue C-terminale d'un compagnon de symétrie couvrant A401 et une partie de l'étiquette His6 (H404–H408) est représentée comme un modèle de bâton avec des carbones en prune, couvrant probablement les sous-sites P6–P1 '. Une molécule de solvant potentiellement pertinente pour la catalyse (sphère verte) relie E297 et E188 (bâtonnets magenta). Une deuxième molécule de solvant (flèche jaune) occupe probablement la position de l'oxygène carbonyle scissile dans le complexe de Michaelis. Les chaînes polypeptidiques des deux formes cristallines se chevauchent pour les résidus d'étiquette H404–H409 (forme cristalline I) et A401–H406 (forme cristalline II) lors de la superposition des CD respectifs. d Modèle du complexe probable de Michaelis entre un substrat couvrant les résidus P – Q – P * Q – L – P (carbones verts) aux positions P3 – P3 'et le site actif de la néprosine. Les résidus sélectionnés sont affichés pour leur chaîne latérale (carbones de prune) et étiquetés. Le solvant catalytique est représenté par une sphère cyan. e Mécanisme chimique proposé du clivage du substrat par la néprosine.

Dans la recherche d'éventuels résidus catalytiques, nous nous sommes inspirés des peptidases aspartiques de type pepsine fonctionnellement analogues, qui malgré leur architecture disparate sont également principalement des protéines β et fonctionnent à pH45 très acide. De plus, les seuls inhibiteurs (faibles) de la néprosine que nous avons pu trouver sont également connus pour inhiber les aspartate peptidases (voir ci-dessus). Ces enzymes utilisent une paire de résidus aspartiques pontés par une molécule de solvant pour la catalyse46. En effet, nous avons trouvé une paire frappante de résidus glutamate (E188 et E297) pontés par une molécule de solvant pinçant les peptides liés dans les complexes de produits (Fig. 6b, c). Dans la forme cristalline II, une deuxième molécule de solvant clairement résolue remplacerait l'oxygène carbonyle scissile d'un substrat (Fig. 6c). La paire de glutamate était disposée de la même manière dans la structure du zymogène, quoique légèrement plus éloignée (Fig. 6a). Nous avons donc produit des mutants ponctuels E188Q, E188A, E297Q et E297A de la pro-néprosine marquée His6 pour les tests (Fig. 1c). Ces variantes ne se sont pas auto-activées lorsqu'elles ont été incubées à pH acide (Fig. 1f), de sorte que l'activation a été déclenchée en trans en utilisant des quantités catalytiques de néprosine de type sauvage marquée par Strep mature. Enfin, nous avons obtenu des variants matures bien repliés et intacts des mutants E188Q et E297Q, mais pas E297A ou E188A (Fig. 1f), et ceux-ci étaient en effet catalytiquement inactifs (Fig. 2f). E188 et E297 pourraient donc agir comme une dyade catalytique, révélant que la néprosine est une glutamate peptidase, une classe catalytique qui (contrairement aux aspartate peptidases) a été très peu étudiée47. Ceci est en accord avec des prédictions très récentes basées sur des études bioinformatiques mais non validées expérimentalement48. Nos résultats suggèrent que les structures de néprosine matures imitent les complexes de produits en amont occupant collectivement les sous-sites S6 à S1 '(Fig. 6b, c), les deux glutamates catalytiques plus la molécule de solvant de pontage étant prêts à réagir. Comme le lieur PD s'étend pour d'autres résidus sur le côté droit de la fente dans le zymogène (Fig. 6a), ceux-ci correspondraient à des positions jusqu'à P3 '. Ainsi, avec l'espace supplémentaire dans la fente au-delà de S3 ', la néprosine comporterait une fente étendue, couvrant probablement jusqu'à 11 sous-sites (S6 – S5 '), ce qui explique le besoin de peptides étendus au-delà de la liaison scissile (voir ci-dessus).

En l'absence de complexe de substrat, nous avons construit un modèle pour le complexe de Michaelis de la néprosine avec le peptide P – Q – P * Q – L – P basé sur les structures imitant le zymogène et le complexe produit (Fig. 6d). Ce modèle a révélé d'autres résidus à proximité des glutamates catalytiques avec des fonctions potentielles de liaison ou catalytiques. Nous avons donc muté les résidus H134, Y136, Q173, W175 et Y214 (Fig. 6a–d) en les remplaçant par de l'alanine, et purifié les protéines correspondantes (Fig. 1c). Tous les mutants ont nécessité une activation en trans comme indiqué ci-dessus (Fig. 1f). L'activité de H134A, Y136A et Y214A était d'environ 80 % inférieure à celle de l'enzyme de type sauvage, tandis que les mutants Q173A et W175A étaient totalement inactifs (Fig. 2f). Nous concluons que H134, Y136 et Y214 sont pertinents mais non critiques pour la catalyse, jouant peut-être un rôle auxiliaire dans le mécanisme catalytique, alors que Q173 et W175 sont essentiels (voir ci-dessous).

Le PD se fixe latéralement sur le côté gauche de l'enzyme mature de sorte que sa feuille β centrale est tournée à environ 90 ° du plan de la feuille avant. La surface inter-domaine a un gain d'énergie sans solvatation lors de la formation de l'interface (ΔiG) de –25,8 kcal/mol49, indiquant une très forte interaction. De plus, le complexe enfouit 2176 Å2, ce qui dépasse la valeur moyenne rapportée de 1910 Å2 pour les complexes protéine-protéine50. Le PD (pI théorique = 9,5 ; Fig. 5e, en bas) est en forme de croissant et embrasse confortablement le CD (pI = 4,3 ; Fig. 5e, en haut) sous complémentation électrostatique, ce qui contribue à la répression de l'activité et à la stabilité du zymogène (pI = 5,9 ) à pH neutre ou légèrement acide. De plus, l'interaction zymogène intime explique en outre la remarquable stabilité de la pro-néprosine dans les essais de décalage thermique (voir ci-dessus). Enfin, l'importance de la PD a été évaluée plus en détail en testant le mutant ponctuel A60R, conçu pour déstabiliser l'interface (Fig. 5c, panneau de gauche). Cette mutation a empêché l'isolement d'une protéine repliée.

Une fois sécrétée dans le liquide digestif acide, la protonation des résidus chargés négativement conduit à la répulsion des charges positives nettes de sorte que le zymogène se désagrège sous la libération de la fraction mature préformée et de la fente du site actif. La position S1 de la fente est occupée par K118 du lieur PD dans la structure du zymogène, qui a été obtenu à pH 7,5. Ce résidu forme un pont salin fort avec E188 catalytique et une liaison hydrogène avec Q173Nε2, ce qui est essentiel (voir ci-dessus et Fig. 6a, encadré). Nous avons donc produit et testé le mutant K118A, qui était efficacement surexprimé mais a subi une maturation autolytique partielle dans un tampon neutre, conditions dans lesquelles l'enzyme de type sauvage et les autres mutants sont restés intacts (Fig. 1c). Une incubation ultérieure à pH 2,5 a terminé le processus d'activation (Fig. 1f). Comme prévu, l'activité du mutant mature était similaire à celle de l'enzyme de type sauvage (Fig. 2f).

Sur la base de ce qui précède, nous proposons que la paire K118 – E188 comporte un bouchon de latence qui peut être affaibli une fois que le zymogène atteint un environnement acide en suivant un mécanisme de changement de pH, de sorte que le lieur PD est retiré pour le clivage de maturation. Cela rappelle les aspartate peptidases digestives pepsine et gastricsine, qui présentent un résidu lysine fonctionnellement équivalent à K11843,51, et la peptidase lysosomale legumain52. Le mécanisme de commutation du pH et le fait que la liaison peptidique scissile P1′ – P1 est prise en sandwich par la chaîne latérale Y214 de sorte qu'elle n'est pas accessible pour le clivage (Fig. 6a), expliquent pourquoi le lieur zymogène peut se lier dans la direction de un substrat à la fente à pH neutre sans être clivée. Cela contraste avec la plupart des zymogènes, y compris les aspartates peptidases digestives, dans lesquelles les pro-segments interagissent d'une manière non semblable à un substrat avec les résidus d'enzymes matures comme mécanisme pour empêcher une activation intempestive42,43,44. Enfin, étant donné que la position de la liaison scissile dans la fente est occupée par K118 – Q119 mais que la maturation se produit à P128 – S129, l'activation se produit probablement en trans par une deuxième molécule d'enzyme une fois que le lieur PD est libéré de la fente.

Sur la base des résultats précédents, le mécanisme de clivage catalytique de la néprosine se déroulerait comme suit. Le solvant reliant les carboxylates E188 et E297 dans les complexes de produits représenterait l'eau catalytique à l'état fondamental (Fig. 6e, étape I). L'eau est plus proche de E297, ce qui suggère que E188 peut être protoné, comme rapporté pour l'un des deux aspartates catalytiques dans les peptidases acides de type pepsine46. E297 est maintenu en place par liaison hydrogène avec H134Nε2 et Y136Oη, tandis que E188 est maintenu en place par liaison hydrogène avec Y214Oη, T186Oγ et Q173Nε1. Au cours de la réaction, le substrat se lierait à la fente du site actif en conformation étendue (Fig. 6e, étape II), les sous-sites S3, S1 et S3 'de la fente étant façonnés par Y194, Q192 et F169 ; Y208, Y206, L171, E188 et Q173 ; et Y136, W175 et E293, respectivement, qui sont idéales pour l'hébergement des prolines (Fig. 6d). La chaîne principale du substrat serait fixée par des liaisons hydrogène entre ses carbonyles et Y220Oη dans P3, H134Nε2 dans P2 (activée par une rotation de 180º autour de χ2 lors de la liaison au substrat) et Y136Oη dans P1 '(Fig. 6d). L'insertion du substrat déplacerait davantage le solvant catalytique vers E297, qui agirait comme une base générale et en extrairait un proton pour améliorer sa nucléophilie. Le carboxylate E188 protoné, à son tour, se lierait à l'oxygène carbonyle scissile (Fig. 6d, e). Par la suite, le solvant polarisé effectuerait une attaque nucléophile sur la face si du carbone carbonyle scissile, ce qui se traduirait par un intermédiaire de réaction gem-diolate tétraédrique (Fig. 6e, étape III). Ce dernier serait stabilisé par les indispensables W175Nε1 et Q173Nε1, dans le rôle critique d'un trou d'oxyanion53. L'intermédiaire se résoudrait alors en rompant la liaison scissile C – N. À ce stade, E297 agirait comme un acide général et protonerait le nouvel azote α-aminé (Fig. 6e, étape IV). Enfin, les deux produits de clivage quitteraient la fente et l'enzyme serait prête pour un nouveau cycle de catalyse.

À l'origine, les peptidases étaient réparties en cinq classes mécanistes : les sérines, les cystéines, les thréonines, les aspartates et les peptidases métal-dépendantes54. En 2004, la glutamate peptidase fondatrice a été structurellement caractérisée, à savoir la scytalidocarboxyl peptidase B (SCP-B) du champignon dématié Scytalidium lignicolum55,56,57. Depuis lors, seule la peptidase aspergilloglutamique étroitement apparentée (~ 50% identique à SCP-B) a été analysée structurellement58,59, et sept autres ont été évaluées fonctionnellement, principalement à partir de champignons60,61,62,63,64 mais une d'une bactérie65 . Ils sont affectés à la famille G1 dans la base de données MEROPS et sont connus de manière informelle sous le nom de groupe carboxylpeptidase fongique insensible à la pepstatine66 ou eqolysines55. Ce sont des enzymes thermophiles et insensibles à la pepstatine qui fonctionnent dans des conditions acides65 et comportent un glutamate catalytique agissant comme une base générale polarisante du solvant, qui est E190 dans SCP-B (voir UniProt ID P15369 pour la numérotation des résidus en indice selon la pleine longueur protéine, et soustrayez 54 pour la numérotation des enzymes matures couramment utilisée55,56). Le glutamate est assisté par une glutamine (Q107 dans SCP-B), d'où le nom de famille eqolysins55. Ces résidus sont invariants au sein de la famille et sont flanqués de résidus très similaires66,67.

L'archétype SCP-B est un sandwich β antiparallèle 7 + 7 qui présente une similitude globale avec la néprosine CD (Fig. 7a). La superposition de la néprosine et de la forme mature liée de SCP-B (Protein Data Bank [PDB] ID 2IFR56), dont la structure zymogène est inconnue, a révélé 140 résidus alignés avec un noyau RMSD assez large de 3,0 Å et une identité de séquence de seulement 11 % . Il existe des différences remarquables dans les boucles de connexion et le site actif, par exemple une grande épingle à cheveux β saillante liée au disulfure insérée dans l'enzyme fongique après le brin β équivalent à β16 dans la néprosine (Fig. 7a). Au sein du site actif, le seul résidu conservé est le glutamate catalytique (E297 dans la néprosine et E190 dans SCP-B), ainsi que la position de l'assistant catalytique (E188 dans la néprosine et Q107 dans SCP-B), qui conduisent à des fentes du site actif avec des trajectoires de substrat et des profils de surface disparates (Fig. 7b, c). De plus, les mutants croisés Q107E de SCP-B et E188Q de la néprosine, qui imitent la dyade catalytique de l'autre, sont complètement inactifs, comme discuté ci-dessus et rapporté dans68. Cela explique les différentes spécificités de substrat, qui dans SCP-B conduisent au clivage des liaisons F–F, L–Y et F–Y dans l'insuline mais pas des liaisons flanquant la proline68.

a Superposition des traces Cα de néprosine (saumon) et de SCP-B (bleu pâle) en stéréo, avec les résidus catalytiques respectifs représentés sous forme de bâtonnets et marqués (➀, E297/E190 de néprosine/SCP-B ; ➁, E188/ Q107 de néprosine/SCP-B). Notez le lambeau unique de SCP-B recouvrant la fente du site actif (flèche rouge). L'extrémité N-terminale et l'extrémité C-terminale sont indiquées. b Gros plan de la fente du site actif de la néprosine illustrée pour sa surface Connolly dans l'orientation de (a). Les deux résidus catalytiques sont représentés (taches vertes). c Identique à (b) pour SCP-B.

Les gluténases actuelles ont des limites pour répondre aux critères rigoureux d'une thérapie enzymatique orale efficace contre le CoD. Ici, nos études in vitro et in vivo ont montré que la néprosine recombinante est une enzyme robuste résistante à la pepsine qui dégrade très efficacement la gliadine et son 33-mer dans des conditions gastriques simulées en laboratoire et dans l'estomac de la souris. De faibles doses de l'enzyme complètent donc la pepsine gastrique lors de la digestion. Nos résultats démontrent que le motif Q–P*Q–L du 33-mer est facilement clivé, ce qui élimine les six épitopes immunogènes qui se chevauchent en générant des peptides trop petits pour stimuler la division des lymphocytes T spécifiques de la gliadine69. L'efficacité de clivage de la néprosine in vitro dans des conditions gastriques simulées est de plusieurs ordres de grandeur supérieure à celle des autres glutases18,20,24,70,71,72. Le zymogène est produit à pH neutre, auquel il reste stable et est lyophilisable pour le transport et le stockage. Il ne s'active qu'après ingestion dans l'estomac et clive les composants toxiques du gluten. Une fois que le bolus gastrique sort vers le duodénum à pH postprandial légèrement acide, il redevient inactif. La néprosine est donc un candidat très prometteur pour un développement thérapeutique ultérieur contre les affections sensibles au gluten.

Des études structurelles et fonctionnelles soutenues par des mutants et des tests d'activité ont identifié la néprosine comme une PEP sensible à la pepstatine et la seule glutamate endopeptidase trouvée chez les eucaryotes supérieurs. Il comporte une paire jusqu'ici non décrite de glutamates catalytiques qui sont analogues aux aspartates des endopeptidases acides de type pepsine autrement non apparentées. La néprosine est produite et sécrétée sous forme de zymogène, qui n'est activé que dans son environnement naturel fortement acide, le liquide digestif de la plante sarracénie. La maturation suit un mécanisme de changement de pH qui libère un bouchon de latence médié par la lysine.

Enfin, la néprosine est sensible à la pepstatine mais partage son repli global avec les glutamate peptidases résistantes à la pepstatine de la famille des eqolysines, qui possèdent une dyade glutamate-glutamine et sont représentées par l'archétype SCP-B. Cependant, il existe des différences dans la taille du PD et du CD, l'environnement du site actif, le mode et la spécificité de liaison au substrat, ainsi que le mécanisme chimique de la catalyse. De plus, alors que les eqolysines sont limitées aux champignons et aux bactéries67,73, les orthologues potentiels de la néprosine avec une identité de séquence d'environ 35 à 40 % sont largement présents (et limités) aux plantes, y compris les cultures contenant du gluten. Cela suggère que la famille des néprosines pourrait provenir d'un ancêtre SCP-B par transfert horizontal de gènes d'une bactérie ou d'un champignon à une plante, comme décrit précédemment pour d'autres protéines74. Le transfert aurait été suivi d'une évolution divergente au sein du règne végétal pour modifier l'un des résidus catalytiques et les boucles ornant le sandwich β central pour s'adapter à de nouveaux substrats. Par analogie avec les eqolysines, les membres de la famille des néprosines pourraient être nommés eelysines.

Un gène synthétique codant pour la néprosine de type sauvage de Nepenthes × ventrata, identique à 91 % à l'orthologue de Nepenthes alata (UniProt ID A0A1L7NZU4), a été inséré dans le vecteur pET-28a(+) par GenScript pour produire le vecteur pET-28a(+ )-proNEP (pour les plasmides et les amorces, voir le tableau supplémentaire 2). La séquence codante a été transférée au vecteur pCMV pour produire le vecteur pS6-proNEP. Cela a conféré une résistance à l'ampicilline et a ajouté une étiquette d'hexahistidine C-terminale (His6). La protéine codée est décrite ici sous le nom de pro-néprosine. Le même plasmide a été modifié par clonage d'oligonucléotides annelés pour (a) remplacer l'étiquette His6 par une étiquette Strep jumelle (pS6-proNEP-Strep) pour l'expression de pro-néprosine-strep, et (b) pour éliminer le PD (pS6 -NEP) pour l'expression de la néprosine CD (S129-Q380) plus l'étiquette His6 C-terminale. Le kit de mutagenèse dirigée QuikChange (Stratagene) ou la mutagenèse dirigée basée sur la PCR inverse ont été utilisés pour générer des variantes de pS6-proNEP avec des mutations ponctuelles A60R, K118A, H134A, Y136A, Q173A, W175A, E188A, E188Q, Y214A, E297Q et E297A. Les plasmides ont été purifiés avec le kit GeneJET Plasmid MaxiPrep (Thermo Fisher Scientific) et les constructions ont été vérifiées par séquençage d'ADN.

Les protéines codées par les plasmides pS6-proNEP, pS6-proNEP-Strep et pS6-NEP, ainsi que les 11 mutants ponctuels, ont été évaluées pour la surexpression dans des cellules humaines Expi293F (ThermoFisher Scientific) cultivées dans un incubateur à agitation cellulaire Multitron (Infors HT) à 37 °C. Les cellules ont été transfectées avec de l'ADN plasmidique et récoltées après plusieurs jours pour la purification des protéines. Le milieu conditionné par les cellules a été nettoyé par centrifugation et additionné d'imidazole, incubé avec une résine d'acide nickel-nitrilotriacétique (Ni-NTA) (Invitrogen), soumis à une purification par chromatographie d'affinité par lots (AC) et lavé abondamment avec un tampon contenant 20 mM d'imidazole. Les protéines ont été éluées avec le même tampon contenant 300 mM d'imidazole. Pour la pro-néprosine-strep, la résine Ni-NTA a été remplacée par la résine de suspension Strep-Tactin XT Superflow (IBA Life Sciences) et les protéines ont été éluées dans un tampon contenant 50 mM de d-biotine (VWR Life Science). Les fractions contenant la protéine ont été regroupées et concentrées avant la chromatographie d'exclusion de taille (SEC) dans une colonne Superdex 75 10/300 GL (GE Healthcare), qui était fixée à un système de chromatographie liquide ÄKTA Purifier (GE Healthcare).

Les protéines ont été concentrées par ultracentrifugation dans des dispositifs de filtration Vivaspin (Sartorius Stedim Biotech). Les concentrations approximatives de protéines ont été déterminées en mesurant l'absorbance à 280 nm (A280) à l'aide d'un BioDrop-DUO Micro Volume (Biochrom) et en appliquant les coefficients d'extinction théoriques appropriés. De plus, la pureté des protéines a été évaluée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE) suivie d'une coloration au Coomassie (Thermo Fisher Scientific). L'identité des protéines a été déterminée par empreinte de masse peptidique et séquençage d'Edman N-terminal au Service de chimie des protéines et au Centre de protéomique du Centro de Investigaciones Biológicas (Madrid, Espagne), respectivement. Enfin, la néprosine mature de type sauvage a été lyophilisée, stockée à -20 ° C et reconstituée par dissolution dans de l'eau Milli-Q.

Pour les tests d'activité, le milieu conditionné filtré de néprosine de type sauvage et les mutants ponctuels ont été additionnés de 3 mM de glutathion réduit et de 0,3 mM de glutathion oxydé, le pH a été ajusté avec 20 mM de Tris·HCl pH 8,0 et le mélange a été incubé avec cOmplete Résine de purification His-Tag (Roche). La résine a été recueillie dans une colonne ouverte et la protéine liée a été lavée avec Tris.HCl 10 mM pH 7,0, chlorure de sodium 300 mM, puis éluée avec de la glycine 100 mM pH 2,5, chlorure de sodium 300 mM.

Des formes sauvages et mutantes matures de la néprosine ou de la néprosine-streptocoque ont été obtenues par autolyse. Des échantillons de protéines élués à partir de colonnes Ni-NTA ou Strep-Tactin ont été dialysés contre un tampon, dilués deux fois avec 100 mM de glycine pH 2, 5 et incubés à 37 ° C pendant 16 h maximum. Les réactions ont été arrêtées à des moments précis (0 min, 10 min, 20 min, 30 min, 1 h, 2 h et toute la nuit) en faisant bouillir des aliquotes dans un tampon d'échantillon SDS réducteur/dénaturant, suivi d'une SDS-PAGE. La néprosine mature a été échangée avec du tampon Tris.HCl 20 mM pH 7,5, chlorure de sodium 250 mM dans une colonne PD10 suivi de SEC dans une colonne Superdex 75 10/300 GL avec le même tampon. La pureté et l'identité des protéines ont été évaluées comme indiqué ci-dessus.

Pour obtenir des mutants ponctuels de néprosine matures à partir de zymogènes qui ne s'auto-activent pas, les pro-protéines purifiées (H134A, Y136A, Q173A, W175A, E188A, E188Q, Y214A, E297Q et E297A) ont été incubées avec de la néprosine-streptocoque activée à un poids de 20:1. rapport pendant une nuit à 37 ° C. La pro-néprosine-strep a été préalablement échangée avec du tampon à 100 mM de glycine pH 3,0, 150 mM de chlorure de sodium pour l'activation. Les échantillons clivés ont été soumis à un échange de tampon et purifiés par chromatographie d'affinité inverse, concentrés et purifiés par SEC.

La pro-néprosine et la néprosine mature ont été analysées par fluorimétrie à balayage différentiel à l'aide d'un système de détection par PCR en temps réel iCycler iQ (Bio-Rad). Les échantillons ont été préparés à 0,5 mg/mL, en présence ou en l'absence de 5 ou 10 mM de tris(2-carboxyéthyl)phosphine (TCEP) comme agent réducteur, et additionnés de 5× SYPRO Orange Protein Stain (Thermo Fisher Scientific). La température de transition médiane (Tm) a été déterminée comme la moyenne de mesures en double de la valeur médiane de la courbe de stabilité.

Nous avons incubé 10 μM du substrat protéique fluorescent DQ Red BSA (Thermo Fisher Scientific) avec 0, 15 μM de néprosine dans 100 μL de tampon à pH 2–8. La fluorescence a été contrôlée à l'aide d'un fluorimètre à microplaque Infinite M2000 (Tecan) à 37 ° C. Nous avons testé la trypsine bovine 0,5 μM (Sigma-Aldrich) et la pepsine porcine (Fluka) à des fins de comparaison. Chaque essai a été réalisé en triple exemplaire.

Les paramètres cinétiques du clivage du peptide FS6-QPQL (Mca–Q–P–Q–L–Dpa–A–R–NH2 ; GenScript) par la néprosine de type sauvage (concentration enzymatique finale de 25 nM), ainsi que ceux du FS6 peptide (Mca–K–P–L–G–L–Dpa–A–R–NH2 ; Sigma-Aldrich) par la néprosine à une concentration enzymatique finale de 100 nM, ont été déterminées dans des réactions contenant 100 mM de glycine pH 3,0 et des concentrations de substrat de 1 –75 μM (FS6-QPQL) ou 2,5–75 μM (FS6) à 37 °C. Le signal de fluorescence, représentant la formation du produit de clivage, a été enregistré au fil du temps pour chaque concentration de substrat et le taux initial (v0) a été dérivé de la pente de la partie linéaire de la courbe. En utilisant une gamme de concentrations de substrat et un surplus de peptidase, nous avons mesuré le signal de fluorescence généré après un renouvellement complet du substrat et calculé les unités de fluorescence correspondantes par picomole de substrat clivé. Ces valeurs ont été tracées par rapport à la concentration de substrat et ajustées à l'équation hyperbolique de Michaelis-Menten (v = Vmax·[S]/{KM+[S]}) par régression non linéaire à l'aide de GraphPad75 et SigmaPlot76 pour déterminer la vitesse maximale (Vmax), la Michaelis la constante d'affinité du substrat (KM), le taux de renouvellement (kcat = Vmax/[Etotal]) et l'efficacité catalytique (kcat/KM) de la réaction de clivage. Toutes les expériences ont été réalisées en triple.

L'activité peptidolytique de la néprosine de type sauvage a été comparée à celle des mutants K118A, H134A, Y136A, Q173A, W175A, E188Q, Y214A et E297Q (140 ng) en utilisant 10 μM du peptide fluorogène FS6-QPQL dans 100 mM de glycine pH 3,0 , chlorure de sodium 150 mM à 37 °C, sous agitation dans un lecteur de microplaques Synergy H1 (BioTek). Pour garantir un traitement d'échantillon identique, tous les variants protéiques ont été activés avec de la néprosine-strep, qui a ensuite été éliminée par chromatographie d'affinité inverse comme indiqué ci-dessus. La concentration en protéines a été estimée à partir de la surface des courbes A280 SEC et corrigée en fonction des valeurs ε280. Les valeurs de fluorescence après 30 min ont été utilisées comme paramètres d'activité. Les expériences ont été réalisées en triple et les différences ont été analysées pour leur signification statistique à l'aide de GraphPad.

La gliadine de blé (Sigma-Aldrich) a été préparée dans 100 mM de glycine pH 2,5 et des concentrations variables de pepsine (0,05 à 10 μM) de muqueuse gastrique porcine (Fluka), de néprosine (0,05 à 2 μM) ou de mélanges de 0,5 μM de pepsine et de 0,05 -2 μM de néprosine ont été utilisés pour digérer des suspensions de gliadine à 10 mg/mL. Les réactions ont été suivies par turbidimétrie dans des plaques à 96 puits (Corning) à 37°C dans un spectrophotomètre à microplaques (BioTek). Les réactions ont été stoppées par ébullition dans un tampon d'échantillon SDS avant analyse par SDS-PAGE. La dégradation de la gliadine par la néprosine a également été analysée par zymographie à l'aide de gels SDS-PAGE contenant soit de la gliadine de blé, soit de la gélatine téléostéenne (Sigma-Aldrich), qui a servi de témoin, à 0,1 mg/mL. La pro-néprosine a également été testée, qui s'est activée à la forme mature au cours de l'essai. Les protéines ont été renaturées en lavant les zymogrammes avec 2,5 % de Triton X-100 dans 100 mM de glycine pH 2,5, 200 mM de chlorure de sodium. Après d'autres lavages avec le même tampon plus 0,02 % de Brij-35, les zymogrammes ont été incubés pendant une nuit dans le même tampon, rincés brièvement avec de l'eau et colorés au Coomassie.

Le clivage du peptide 33-mer de l'α-gliadine de blé (LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF, 3911 Da) a été contrôlé à l'aide d'un spectromètre de masse AutoFLEX III MALDI-TOF. Le peptide (de GenScript) a été dissous dans de l'eau à une concentration d'environ 20 mg/mL et stocké à -20 °C. La réaction de clivage a été réalisée avec un substrat d'environ 1 mg / ml (~ 250 μM) dans de la glycine 100 mM pH 3, 0 à 37 ° C en ajoutant de la néprosine 0, 5 μM ou de la pepsine 10 μM. Les réactions ont été arrêtées à différents moments (0 min, 10 min, 20 min, 45 min, 1 h et toute la nuit) et les échantillons ont ensuite été dilués à 1:10 avec de l'eau, mélangés avec un volume égal de matrice d'acide 2,5-dihydroxybenzoïque. à 10 mg/mL dans une solution contenant 30 % d'acétonitrile et 70 % d'acide trifluoroacétique à 0,1 %, et déposé sur une plaque d'acier rectifiée (Bruker). Les spectres de masse ont été acquis en mode réflectron positif à une tension d'accélération totale de 21 kV.

Nous avons réanalysé les données de spécificité de clivage de la néprosine endogène ou du matériel recombinant obtenu à partir d'Escherichia coli déposé à Chorus (Projet ID 126225). Les fichiers bruts LC-MS/MS ont été convertis au format MGF et les données ont été traitées à l'aide de TANDEM, Comet et MS-GF+, comme implémenté dans SearchGUI77. Les résultats ont été évalués à l'aide de PeptideShaker78 avec un taux de fausse découverte de 1 %. Les données ont été recherchées de manière non spécifique pour les coups contre le protéome humain dans UniProt (mars 2020) en utilisant une tolérance de masse de 20 ppm pour MS1 et MS2, la carbamidométhylation de la cystéine fixe et l'oxydation de la méthionine variable. Jusqu'à 50 clivages manqués ou un maximum de 5500 Da ont été tolérés pour la masse peptidique parentale.

Concernant la recherche d'inhibiteurs de la néprosine, nous avons dosé le cocktail d'inhibiteurs complets à large spectre (Roche) ; les inhibiteurs de métallopeptidase 1,10-phénathroline, phosphoramidon, marimastat et captopril (tous de Sigma-Aldrich); l'inhibiteur de sérine peptidase 4-(2-aminoéthyl)-fluorure de benzènesulfonyle (AEBSF; Sigma-Aldrich); les inhibiteurs de l'aspartate peptidase pepstatine A (Sigma-Aldrich), méthyl-2-[(2-diazoacétyl)amino]hexanoate (DAN ; Chemical Abstracts Service (CAS) 7013-09-4 ; Bachem 4010441) et ENPN (CAS 5255- 75-4; Apollo Scientific OR26560); ainsi que les composés contenant/imitant la proline 2-acétyl-1-méthylpirrole (AMP ; CAS 932-16-1 ; Sigma-Aldrich 160865) ; (S)-tert-butyl-2-(3-éthoxy-3-oxopropanoyl)pyrrolidine-1-carboxylate (BEOPC; CAS 109180-95-2; Fluorochem 387901); et N-boc-glycylproline (BGP; CAS 14296-92-5; Bachem 4003703). L'inhibition du clivage du peptide FS6-QPQL a été étudiée en pré-incubant 100 nM de néprosine dans 100 mM de glycine pH 3, 0 avec 100 μM de chaque composé testeur pendant> 1 h à 37 ° C. Nous avons ensuite ajouté 10 μM du substrat et l'activité résiduelle a été surveillée pendant 4 h sous forme d'augmentation de la fluorescence. Les différences ont été analysées pour leur signification statistique à l'aide de GraphPad. Le témoin positif en l'absence d'inhibiteurs (100 % d'activité) contenait la même concentration finale de diméthylsulfoxyde que celle utilisée pour solubiliser les inhibiteurs. De plus, des valeurs de concentration inhibitrice demi-maximale (CI50) ont été déterminées pour la pepstatine A et l'ENPN en mesurant l'activité de la néprosine 50 nM en présence de 10 μM de concentrations de substrat et d'inhibiteur de 5 à 500 μM et 5 à 5 000 μM, respectivement , pour obtenir les courbes d'inhibition. Ces courbes ont été analysées par régression non linéaire à l'aide de GraphPad.

Les procédures expérimentales impliquant des souris ont suivi les directives institutionnelles pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire et les directives ARRIVE. Les protocoles ont été approuvés par le Comité d'éthique pour l'expérimentation animale de l'Université de Barcelone (CEEA-UB/Réf. 186/20-P2) et le Gouvernement de Catalogne (PAMN/Réf. 11485), qui ont suivi la directive 2010/63/UE pour la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques. La taille de l'échantillon a été estimée par le programme Appraising Project Office de l'Université Miguel Hernández d'Elx (Alacant, Espagne). Nous avons utilisé des souris C57BL/6 mâles et femelles âgées de 5 semaines (n = 16) achetées chez Janvier et hébergées à l'animalerie de la Faculté de Pharmacie et des Sciences Alimentaires de l'Université de Barcelone dans un environnement contrôlé (20–24 ° C, 40–60 % d'humidité relative) et une photopériode de 12 h, avec des lumières allumées à 8 h et éteintes à 20 h. -Camps) et structures d'escalade en carton pour l'enrichissement des cages. Les animaux avaient libre accès à l'eau et à la diète RM3 (P) SQC (Special Diet Services).

Après 1 semaine d'acclimatation, deux groupes de souris ont été sélectionnés au hasard, comprenant chacun quatre mâles et quatre femelles (n = 8 par groupe) et ont été marqués néprosine (N) ou véhicule (V). Les animaux n'étaient pas à jeun pour tenir compte du temps de transit physiologique, et la nourriture et l'eau n'étaient retirées qu'une heure avant le gavage oral. Les souris du groupe N ont reçu 50 μL de pro-néprosine dans un véhicule (0, 2 mg / ml dans une solution saline tamponnée au Tris 20 μM pH 7, 5, 150 μM de chlorure de sodium), tandis que les souris du groupe V ont reçu 50 μL de véhicule seul. Après 5 min, toutes les souris ont reçu 50 μL de bouillie de gliadine contenant 5 mg de gliadine de blé (Sigma-Aldrich) à 100 mg/mL dans une solution d'éthanol à 10 % à l'aide de seringues Hamilton de petit volume et de sondes orales adaptées. Le rapport enzyme:gliadine (1:500) a été calculé sur la base de nos résultats in vitro, qui avaient montré que la néprosine digère la gliadine à un rapport de 1:500-1000 à 37 ° C sur une période de 90 min. Étant donné que le transit gastro-intestinal chez la souris amène un bolus à atteindre l'intestin grêle après 1 à 3 h, une partie du contenu pénétrant déjà dans le gros intestin79, nous avons sélectionné 2,5 h comme critère optimal pour évaluer la dégradation de la gliadine dans le tractus gastro-intestinal supérieur. Les animaux ont ensuite été euthanasiés par dislocation cervicale et le contenu de l'estomac, de l'intestin grêle proximal et de l'intestin grêle distal a été prélevé, pesé et congelé à -20 °C.

Les échantillons ont été mis en suspension dans une solution saline tamponnée au phosphate (pH 7,2) à une concentration de 200 mg/mL, homogénéisés avec un moteur sans fil Kimble Pellet Pester (DWK Life Sciences) et extraits d'abord avec un tampon à 50 °C pendant 40 min, puis avec Éthanol à 80 % à 20–25 °C pendant 1 h. Les mélanges ont été centrifugés (2000 × g, 10 min, 4 ° C) et la couche aqueuse entre les couches particulaire et grasse a été éliminée. La teneur en 33-mères de chaque extrait dilué a été analysée à l'aide du kit de test ELISA AgraQuant Gluten G12 (Romer Labs), qui a une limite de détection de 2 ppm, selon les instructions du fabricant. L'anticorps G12 détecte le 33-mer mais aucun autre fragment de dégradation de la gliadine80. Les quantités finales ont été normalisées en tenant compte du poids de l'échantillon et les résultats ont été exprimés en moyenne ± SEM. Le progiciel statistique pour les sciences sociales (SPSS v22.0 ; IBM) a été utilisé pour l'analyse statistique. Les données ont montré une homogénéité de la variance (test de Levene) et suivi une distribution normale (test de Shapiro-Wilk), nous avons donc appliqué une analyse de variance unidirectionnelle conventionnelle (ANOVA).

Nous avons examiné les conditions de cristallisation à la plate-forme de cristallographie automatisée conjointe IBMB/IRB en utilisant la méthode de diffusion de vapeur en goutte assise. Des cristaux de pro-néprosine optimaux (~20 mg/mL dans du Tris·HCl 20 mM pH 7,5, du chlorure de sodium 150 mM) ont été obtenus à 20 °C avec de l'acétate de sodium 0,1 M pH 4,0, 22 % polyéthylène glycol (PEG) 6000, 10 % l'isopropanol comme solution réservoir. Les cristaux ont été récoltés à l'aide de cryo-boucles (dimensions moléculaires), rapidement passés à travers un cryo-tampon constitué d'une solution réservoir plus 15 % (v/v) de glycérol, et vitrifiés dans de l'azote liquide pour la collecte de données. Un dérivé de lutétium de la pro-néprosine a été obtenu en trempant des cristaux natifs pendant 5 min dans un cryo-tampon additionné de 100 mM du cristallophore Lu-Xo4 (Polyvalan)40 et en les vitrifiant flash sans trempage. Les données de diffraction des rayons X ont été recueillies à partir de cristaux natifs à 100 K sur un détecteur de pixels Pilatus 6M-F à la ligne de lumière I04-1 de la Diamond Light Source (Harwell, Royaume-Uni). Les données dérivées du lutétium ont été enregistrées sur un détecteur Pilatus 6M à la ligne de lumière XALOC du synchrotron ALBA (Cerdanyola, Catalogne, Espagne) exploité avec le logiciel Generic Data Acquisition (GDA).

Le complexe néprosine-produit mature (forme cristalline I) a été obtenu à une concentration de protéines d'environ 16 mg/mL dans 20 mM de Tris·HCl pH 7,5, 250 mM de chlorure de sodium à 4 °C en utilisant 10 % de PEG 1000, 10 % de PEG 8000 comme solution réservoir. Les cristaux ont été cryoprotégés avec la même solution réservoir plus 15 % (v/v) de glycérol avant la vitrification éclair dans l'azote liquide. Les données de diffraction des rayons X à 100 K ont été collectées sur la ligne de lumière ID30B du synchrotron ESRF (Grenoble, France) à l'aide d'un détecteur Pilatus 6M. Le complexe néprosine-produit mature sous forme cristalline II a été obtenu à la même concentration de protéine mais dans de la glycine 0,1 M pH 3,0, du chlorure de sodium 150 mM à 20 °C en utilisant du citrate de sodium tribasique 0,1 M pH 5,6, du sulfate d'ammonium 0,5 M, du lithium 1 M sulfate comme solution réservoir. Les cristaux ont été cryo-protégés avec une solution contenant 20% (v/v) de glycérol. Les données de diffraction ont été recueillies à la ligne de lumière XALOC sur un détecteur Pilatus 6M.

Les données de diffraction ont été traitées à l'aide de Xds81 et Xscale, et ont été transformées au format MTZ à l'aide de Xdsconv pour les suites de programmes Phenix82 et Ccp483. Tous les cristaux contenaient un monomère dans l'unité cristalline asymétrique et le tableau supplémentaire 1 fournit des statistiques essentielles sur la collecte et le traitement des données.

La structure de la pro-néprosine a été résolue par diffraction anormale à une seule longueur d'onde à l'aide de données recueillies à partir d'un cristal de dérivé de lutétium à la longueur d'onde maximale d'absorption LIII (1, 34 Å) en appliquant le protocole Autosol du package Phenix. La carte de Fourier résultante a ensuite été soumise à une modification de densité supplémentaire avec wARP/ARP84. Un modèle de départ pour Lu-Xo4 a été obtenu par minimisation de l'énergie appliquée aux coordonnées de la fraction chélatant les métaux du composé tel que trouvé dans son complexe avec Tb3+ (Protein Data Bank [PDB] ID 6FRO, nom de résidu 7MT) en utilisant Chimera85. Les coordonnées résultantes au format PDB ont été combinées avec un ion Lu3+ pour la construction du modèle. Par la suite, plusieurs cycles de construction manuelle de modèles dans Coot86 ont alterné avec un raffinement cristallographique à l'aide du protocole Refine de Phenix et du programme BUSTER87. Le modèle final comprenait les résidus de pro-néprosine A29–Q380 sauf S76–Y85 et N122–N131 plus trois résidus C-terminaux supplémentaires de l'étiquette de purification (A401–I402–A403) ; deux fractions Lu-Xo4 à environ la moitié de l'occupation ; deux chaînes de glycane N-liées totalisant cinq résidus de sucre attachés à N145 et N152, respectivement ; deux molécules d'acétate; et 180 molécules de solvant.

La structure de la pro-néprosine native a été résolue par remplacement moléculaire à l'aide du logiciel cristallographique Phaser dans Ccp4 et des coordonnées protéiques de la structure cristalline du dérivé du lutétium. La construction et le raffinement ultérieurs du modèle se sont déroulés comme décrit ci-dessus. Le modèle final comprenait les résidus A29-Q380 sauf Y77-Y85 et N122-N131 plus deux résidus C-terminaux supplémentaires de l'étiquette de purification (A401-I402), deux chaînes de glycanes liées à N totalisant quatre résidus de sucre, ainsi que huit acétate, une molécule d'isopropanol, quatre de glycérol et 257 molécules de solvant.

La structure d'un complexe produit de néprosine mature native sous forme cristalline I a également été résolue par remplacement moléculaire, en utilisant les coordonnées du fragment T132 – I402 de la pro-néprosine native. La construction et le raffinement ultérieurs du modèle se sont déroulés comme décrit ci-dessus. Le modèle final couvrait les résidus T132 à Q380 plus l'étiquette C-terminale entière (A401 à I402 à A403 + H404 à H409), deux chaînes de glycanes liées à N totalisant sept résidus de sucre, plus un triéthylène glycol et 171 molécules de solvant. La structure d'un complexe produit de néprosine mature native sous forme cristalline II a également été résolue par remplacement moléculaire, en utilisant le fragment T132 – Q380 du complexe de forme cristalline I. Le modèle final comprenait les résidus T132 – Q380 plus l'étiquette C-terminale sauf H409 (A401 – I402 – A403 + H404 – H408), ainsi que deux chaînes de glycanes liées à N totalisant quatre résidus de sucre plus un cation nickel, trois anions sulfate, une tétraglycine et une glycine, ainsi que 250 molécules de solvant. L'ion nickel, vraisemblablement de la résine Ni-NTA utilisée pour la purification, a été provisoirement attribué sur la base de courtes distances de ligation à deux résidus d'histidine (~ 1,8 Å), qui étaient plus proches de ceux rapportés pour les ions nickel à coordination tétraédrique (1,88 Å en moyenne ) qu'à celles du lithium plus abondant (2,03 Å) de la solution réservoir88. Une tétraglycine a été provisoirement placée dans une région de densité adéquate en fonction de la capacité de cet acide aminé à s'oligomériser dans certaines conditions89. Le tableau supplémentaire 1 fournit des statistiques essentielles sur les modèles finaux raffinés, qui ont été validés à l'aide du service de validation wwPDB à https://validate-rcsb-1.wwpdb.org/validservice et déposés auprès de la PDB à www.pdb.org (codes d'accès 7ZU8, 7ZVA, 7ZVB et 7ZVC).

Les superpositions structurelles et les alignements de séquences basés sur la structure ont été calculés à l'aide du programme SSM dans Coot. Les figures ont été préparées avec Chimera. Des recherches de similarité basées sur la structure ont été effectuées avec Dali90. Les interfaces protéiques ont été calculées avec PDBePISA sur www.ebi.ac.uk/pdbe/pisa. La surface d'interaction d'un complexe a été définie comme la moitié de la somme des surfaces enfouies de l'une ou l'autre des molécules.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Toutes les données et tous les réactifs sont disponibles gratuitement auprès des auteurs sur demande raisonnable et signature d'accords de non-divulgation et de transfert de matériel pour une utilisation à but non lucratif par des groupes universitaires. Les données sources sont fournies avec ce document. Les coordonnées atomiques sont disponibles auprès de la Protein Data Bank sous les codes 7ZU8, 7ZVA, 7ZVB et 7ZVC. Les données sources sont fournies avec ce document.

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Nous sommes reconnaissants à Laura Company, Roman Bonet, Xandra Kreplin et Joan Pous de la plate-forme de cristallographie automatisée IBMB/IRB et du service de purification des protéines pour leur aide lors de la purification et de la cristallisation. Le plasmide pCMV a été gracieusement fourni par Jan J. Enghild, Université d'Århus, Danemark. Les auteurs tiennent également à remercier les synchrotrons ESRF, DIAMOND et ALBA pour le temps de faisceau et le personnel respectif de la ligne de faisceau pour leur aide lors de la collecte des données de diffraction. Cette étude a été financée en partie par des subventions d'organismes publics et privés espagnols et catalans (références de subvention/bourse PID2019-107725RG-I00 à FXG-R., ARB, UE et TG ; BES-2016-076877 à SRM, BES-2015- 074583 à LAM, Beatriu de Pinós 2018BP00163 à UE, 2017SGR3 et Fundació La Marató de TV3 201815 à FXG-R., UE, ARB et TG). Les auteurs remercient Richard M. Twyman pour l'édition du manuscrit.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Laura del Amo-Maestro, Soraia R. Mendes.

Laboratoire de protéolyse ; Département de Biologie Structurale, Institut de Biologie Moléculaire de Barcelone (CSIC), Parc Scientifique de Barcelone ; c/Baldiri Reixac, 15-21, 08028, Barcelone, Catalogne, Espagne

Laura del Amo-Maestro, Soraia R. Mendes, Arturo Rodríguez-Banqueri, Laura Garzon-Flores, Tibisay Guevara, Ulrich Eckhard & F. Xavier Gomis-Rüth

Section de Physiologie; Département de biochimie et physiologie ; Faculté de Pharmacie et Sciences Alimentaires, Université de Barcelone, Av. Joan XXIII, 27-31, 08028, Barcelone, Catalogne, Espagne

Marina Girbal, María José Rodríguez-Lagunas, Ángels Franch & Francisco J. Pérez-Cano

Institut de recherche en nutrition et sécurité alimentaire (INSA-UB), Université de Barcelone, Av. Prat de la Riba, 171, 08921, Santa Coloma de Gramenet, Catalogne, Espagne

Marina Girbal, María José Rodríguez-Lagunas, Ángels Franch & Francisco J. Pérez-Cano

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FXGR a conçu et supervisé le projet ; LdAM, TG, LG-F. et SRM a produit et purifié des protéines, généré des mutants et réalisé des études in vitro ; les protéines cristallisées LdAM, ARB et TG ; ARB et UE ont collecté des données de diffraction ; UE a réalisé des expériences, analysé des données et supervisé des travailleurs ; Structures cristallines résolues et raffinées par FXGR ; FJPC, MG, MJRL et À.F. effectué des expériences sur des animaux, et FXGR a écrit le manuscrit avec des contributions de tous les auteurs.

Correspondance au F. Xavier Gomis-Rüth.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie Hans Brandstetter et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Libre accès Cet article est sous licence Creative Commons Attribution 4.0 International License, qui permet l'utilisation, le partage, l'adaptation, la distribution et la reproduction sur n'importe quel support ou format, tant que vous donnez le crédit approprié à l'auteur ou aux auteurs originaux et à la source, fournissez un lien vers la licence Creative Commons et indiquez si des modifications ont été apportées. Les images ou tout autre matériel tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons de l'article, sauf indication contraire dans une ligne de crédit au matériel. Si le matériel n'est pas inclus dans la licence Creative Commons de l'article et que votre utilisation prévue n'est pas autorisée par la réglementation légale ou dépasse l'utilisation autorisée, vous devrez obtenir l'autorisation directement du détenteur des droits d'auteur. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Réimpressions et autorisations

del Amo-Maestro, L., Mendes, SR, Rodriguez-Banqueri, A. et al. Études moléculaires et in vivo d'une prolyl-endopeptidase de classe glutamate pour le traitement de la maladie coeliaque. Nat Commun 13, 4446 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32215-1

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Reçu : 16 mai 2022

Accepté : 21 juillet 2022

Publié: 01 août 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-022-32215-1

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