La composition des tapis microbiens et les schémas de localisation expliquent la virulence de la maladie des bandes noires chez les coraux

npj Biofilms et Microbiomes volume 9, Numéro d'article : 15 (2023) Citer cet article

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La maladie des bandes noires (BBD) chez les coraux se caractérise par un tapis microbien distinctif en forme de bande, qui se propage à travers les tissus et tue souvent les colonies infectées. Le tapis microbien est dominé par les cyanobactéries mais contient également couramment des bactéries oxydant les sulfures (SOB), des bactéries sulfato-réductrices (SRB) et d'autres microbes. Le taux de migration dans le BBD varie selon les différentes conditions environnementales, y compris la température, la lumière et le pH. Cependant, on ne sait pas si les variations des taux de migration reflètent des différences dans le consortium microbien au sein du tapis BBD. Ici, nous montrons que la structure de surface à micro-échelle, la composition bactérienne et la distribution spatiale différaient entre les lésions BBD avec des taux de migration différents. Le taux de migration était positivement corrélé à l'abondance relative des SOB potentiels appartenant aux Arcobacteraceae localisés dans la couche intermédiaire du tapis et négativement corrélé à l'abondance relative des autres SOB potentiels appartenant aux Rhodobacteraceae. Notre étude met en évidence la composition microbienne de la BBD comme un déterminant important de la virulence.

Les cyanobactéries sont souvent des organismes clés qui forment des tapis microbiens dans les environnements naturels. Une caractéristique frappante du tapis de cyanobactéries est sa structure stratifiée et ses couches spécifiques dans lesquelles différents micro-organismes trophiques sont distribués1. Les couches supérieures sont généralement dominées par des cyanobactéries aérobies, des diatomées et d'autres phototrophes oxygénés, tandis que les couches inférieures sont dominées par diverses bactéries anaérobies. Les tapis de cyanobactéries sont présents dans les environnements terrestres et aquatiques tels que les vasières sablonneuses, les étangs hypersalins, les sources chaudes, les zones intertidales et les récifs coralliens1,2,3. Les distributions verticales des bactéries peuvent fluctuer quotidiennement4, et les tapis peuvent s'étendre horizontalement dans des directions radiales5.

La maladie de la bande noire du corail (BBD), caractérisée par un tapis microbien sombre dominé par les cyanobactéries, présente une forme de bande unique qui migre linéairement à travers les tissus coralliens vivants (Fig. 1). La bande noire caractéristique migre sur les tissus coralliens vivants, entraînant la lyse et la nécrose du tissu sous-jacent, et laissant derrière elle un squelette corallien nu6. Les largeurs de la bande noire entre le tissu corallien apparemment normal et le squelette fraîchement exposé peuvent aller de quelques millimètres à sept centimètres7,8. Le taux de migration de la BBD, enregistré jusqu'à 2 cm/jour9, varie avec la température10,11, la lumière10,11, le pH12 et différentes conditions géographiques13. Des différences allant jusqu'à cinq fois dans le taux de migration se produisaient simultanément au sein d'un même récif14.

Représentant BBD sur enclos Montipora sp. colonie (a). Gros plan de l'interface montrant la bande noire, composée d'un tapis de cyanobactéries entre le tissu corallien vivant (région saine) et le squelette blanc de corail exposé (squelette nu) (b).

La biomasse des tapis polymicrobiens est dominée par les genres cyanobactériens filamenteux Oscillatoria, Roseofilum et Pseudoscillatoria qui ont été identifiés respectivement dans l'Indo-Pacifique, les Caraïbes et la mer Rouge15. Ces cyanobactéries appartiennent à une lignée monophylétique et sont systématiquement retrouvées dans les lésions BBD, indiquant leur rôle central dans l'étiologie BBD15. D'autres constituants microbiens courants de la lésion BBD sont SOB (par exemple, Beggiatoa spp16. et Rhodobacterales17), SRB (par exemple, Desulfovibrio18 et Desulfobacteraceae19), certaines bactéries hétérotrophes diverses15 et archaea20. Les cyanobactéries sont situées dans la partie supérieure du tapis microbien ; SOB, SRB et bactéries hétérotrophes se trouvent dans la partie inférieure pendant la journée ; et les bactéries aérobies, y compris les SOB, se déplacent sur la couche cyanobactérienne la nuit15. Un mécanisme pour cette distribution spéciale a été proposé. L'activité des cyanobactéries pendant la journée se traduit par un micro-gradient vertical dynamique d'oxygène8,21. Pendant la nuit, un environnement pauvre en oxygène se forme dans le tapis, puis les SRB prolifèrent et s'activent dans les conditions anoxiques sous le tapis8. La privation d'oxygène et les fortes concentrations de sulfure de SRB sont mortelles pour les tissus coralliens et sont donc considérées comme les facteurs les plus importants dans l'étiologie de la BBD15,22. Les toxines des cyanobactéries ont également été impliquées dans la nécrose des tissus coralliens au niveau du front de la lésion dans certaines études23. Pendant ce temps, les membres de SOB dans BBD sont inexplicables jusqu'à présent. Les membres communs de SOB (tels que Beggiatoa spp. et/ou Rhodobacterales) représentent une composante très mineure des consortiums microbiens BBD qui ont été obtenus à partir d'emplacements géographiques très différents17,19,20,24,25,26,27,28. Cela suggère que l'activité SOB elle-même n'est pas le principal moteur de la pathogenèse de la BBD, mais que sa rareté peut contribuer à l'accumulation de sulfure dans les lésions de la BBD15. Néanmoins, d'autres recherches menées en mer Rouge ont rapporté qu'Arcobacter sp. (c'est-à-dire les autres membres viables du SOB) était très abondant dans les lésions BBD28. De plus, les BBD ont également montré une faible diversité bactérienne et un schéma de composition bactérienne similaire en été lorsqu'ils sont très actifs, par rapport au BBD non actif en hiver et au stade de déclin du BBD en automne29. Un précurseur de BBD, connu sous le nom d'état de patch cyanobactérien (CP), a également montré un faible taux de migration et une grande diversité bactérienne par rapport à l'état BBD normal20. En raison à la fois de la complexité et du dynamisme du consortium microbien BBD, l'étiologie et les mécanismes sous-jacents de la pathogenèse et de la virulence de la BBD restent encore non résolus15, en particulier en ce qui concerne leur lien avec la composition et la localisation bactériennes. De plus, les localisations microbiennes à petite échelle dans les lésions BBD n'ont pas été entièrement expliquées, ce qui pourrait élucider la dynamique BBD-polymicrobienne15.

Pour caractériser le consortium microbien impliqué dans la virulence de la BBD, nous avons examiné comment la composition et la localisation des communautés bactériennes différaient avec le taux de migration de la BBD (un indicateur de virulence). Cette étude a spécifiquement examiné comment les consortiums polymicrobiens au sein des lésions BBD diffèrent selon les taux de migration en utilisant un microscope électronique à balayage (SEM), un séquençage de la communauté bactérienne et une méthode combinée d'hybridation in situ par fluorescence (FISH) et de sectionnement de corail non décalcifié. Pour tenir compte des variations régionales, des échantillons de BBD ont été prélevés dans deux emplacements géographiques à Okinawa, au Japon (Fig. 1 supplémentaire).

Sur l'île de Sesoko et l'île d'Aka, Okinawa (Fig. 1 supplémentaire), 38 lésions BBD (une lésion par colonie ; n = 9 chacune en 2014 et n = 10 chacune en 2015) de différentes profondeurs ont montré des taux de migration linéaire allant de 0,30 à 6,36 mm/jour (Fig. 2a supplémentaire). Aucune corrélation n'a été trouvée entre le taux de migration et la profondeur (corrélation du rang de Spearman, ⍴ = 0,21, valeur p = 0,21). De plus, alors que la température de l'eau fluctuait entre les emplacements et les années (Fig. 2b supplémentaire), il n'y avait aucune différence dans les taux de migration profilés pour chaque emplacement et chaque année (ANOVA à un facteur, F = 0, 95, valeur p = 0, 43). Les dix-huit lésions BBD de 2014 et une sélection aléatoire de douze des 20 lésions BBD de 2015 ont été utilisées dans l'analyse en aval de l'observation SEM et d'une combinaison de profilage bactérien 16 S et FISH, respectivement.

Les images SEM de la surface du tapis BBD adjacente au tissu corallien sain ont montré morphologiquement la présence de nombreux microbes comprenant des cyanobactéries filamenteuses plus fines (Fig. 3a supplémentaire), des cyanobactéries filamenteuses relativement plus épaisses (Fig. 3b supplémentaire), des micro-organismes filamenteux (Fig. 3c supplémentaire), d'autres bactéries en forme de bâtonnet (Fig. 3d supplémentaire) et deux types de ciliés (Fig. 3e-f supplémentaire). Des structures de substances polymères extracellulaires (EPS) ont été observées sur la surface de l'agrégation de cyanobactéries dans les échantillons de l'île d'Aka, alors que des structures d'EPS n'ont généralement pas été observées sur chacun des filaments cyanobactériens individuels de l'île de Sesoko (Fig. 2). Indépendamment de la présence ou de l'absence des matrices EPS, les micro-organismes trouvés dans les tapis BBD des deux endroits étaient morphologiquement similaires. Dans la zone BBD, à moins de 1 mm de la bordure du tissu corallien sain, les cyanobactéries filamenteuses plus fines (Fig. 3a supplémentaire) dominaient systématiquement le tapis dans tous les échantillons, quels que soient leur emplacement et leur taux de migration (Fig. 2). Les cyanobactéries filamenteuses plus épaisses (Fig. 3b supplémentaire) n'ont été trouvées que dans les échantillons avec des taux de migration de 2,74 mm/jour depuis l'île d'Aka et de 4,18 mm/jour depuis l'île de Sesoko. Les micro-organismes filamenteux (Fig. 3c supplémentaire) sont apparus dans les échantillons des deux sites avec des taux de migration de 1,89 mm/jour à 3,99 mm/jour. Les ciliés présentaient deux formes différentes: un corps allongé en forme de tube (Type A, Fig. 3e supplémentaire) et un corps en forme de pastille (Type B, Fig. 3f supplémentaire). Les ciliés de type A et B ont été largement observés à la surface dans les échantillons avec divers taux de migration allant de 0,30 à 5,63 mm/jour et de 1,53 à 5,96 mm/jour, respectivement.

L'échantillon de l'île de Sesoko (a, parties supérieures du panneau b) affichant des filaments cyanobactériens avec des non-impuretés sur les surfaces que l'île d'Aka. Dans l'île d'Aka, les échantillons (parties inférieures des panneaux b et c) ont montré des substances polymères extracellulaires (EPS) sur les surfaces. Comparaison des apparences de surface entre deux emplacements à travers différents taux de migration (b). Les barres d'échelle indiquent 200 µm (a et c) et 20 µm (b). La direction de la migration BBD est de droite à gauche (a et c).

Douze bandes BBD distinctes (une bande par colonie individuelle) avec différents taux de migration linéaire, allant de 2, 13 à 6, 36 mm / jour (Fig. 3a), contenaient une variété de communautés bactériennes (Fig. 3b). La diversité alpha des bactéries (révélée par les OTU observées et les indices de richesse Chao1) était négativement corrélée aux taux de migration (corrélation de rang de Spearman, ⍴ = −0,80, valeur p < 0,01 et ⍴ = −0,74, valeur p < 0,01) (Fig. 3c). À titre de mise en garde, un échantillon de données de composition (SF_04) montrant une faible migration de BBD (2,34 mm/jour) et une grande diversité a été identifié comme une valeur aberrante potentielle (z-score = 3,04). Sans la valeur aberrante, le résultat montrait toujours une corrélation significativement négative avec le taux de migration (corrélation de rang de Spearman, ⍴ = −0,76, valeur p < 0,01 pour les OTU observées, et ⍴ = −0,68, valeur p < 0,05 pour les indices de richesse Chao1). Pour éviter les biais dus aux données de composition dans la corrélation avec la migration, nous avons appliqué une transformation de rapport logarithmique centré (clr) sur nos données pour les analyses en aval et l'avons visualisée dans une analyse en composantes principales basée sur la transformation (tb-PCA ; Fig. 3d ). L'emplacement et la profondeur de l'échantillonnage n'ont eu aucun effet significatif sur les différences dans les communautés bactériennes transformées par le clr au niveau de la famille (PERMANOVA, emplacement : R2 = 0,12, valeur p = 0,21 ; profondeur : R2 = 0,06, valeur p = 0,76 ; et les deux emplacement et profondeur : R2 = 0,07, valeur p = 0,75). Pour évaluer la corrélation entre les matrices de distance basées sur le taux de migration et l'abondance transformée par clr de la communauté bactérienne, un test de Mantel a été effectué et n'a montré aucune corrélation significative (R : 0,06786, valeur p : 0,297). Cependant, le modèle de corrélation partielle entre les bactéries représentatives au niveau de la famille avec les taux de migration a été vérifié par la matrice de transformation clr. Seules deux familles SOB potentielles, les Rhodobacteraceae et les Arcobacteraceae, étaient significativement corrélées négativement et positivement avec les taux de migration linéaire (corrélation de rang de Spearman, ⍴ = -0,59, valeur p < 0,05, ⍴ = 0,85 et valeur p < 0,01), respectivement (Fig. 4 et tableau supplémentaire 3). 44 OTU (unité[s] taxonomique[s] opérationnelle[s]) dans tous les échantillons appartenaient à la famille des Rhodobacteraceae (tableau supplémentaire 1), et seulement deux OTU (OTU 6 et OTU24), allant de 0,01 à 13,47% et de 0,01 à 6,96%, respectivement, avait> 1% de l'abondance relative totale à l'échelle de la somme totale (tableau supplémentaire 2). L'OTU 6 a été attribuée au genre Ruegeria et correspondait exactement à la séquence d'une protéobactérie alpha non cultivée 128-64 (AF473938) extraite de BBD dans la mer des Caraïbes (tableau supplémentaire 2). OTU 24 a été identifiée comme appartenant au genre Thalassobius et était similaire à 100 % à la fois à un clone de bactérie non cultivé BBD-Aug08-3BB-36 (GU472129) et à un clone de bactérie non cultivé Otu0020 (MH341656) dans un tapis BBD de la mer Rouge (tableau supplémentaire 2 ). En tant qu'oxydants de sulfure viables ou bactéries hétérotrophes (voir plus de détails dans la discussion), les Arcobacteraceae ont été trouvées avec 14 OTU dans tous les échantillons de BBD à travers les différents taux de migration, dont trois étaient OTU 8, OTU 9 et OTU11, qui variaient entre 0,54 - 10,84 % dans six échantillons, 0,03 à 10,81 % dans neuf échantillons et 0,01 à 5,46 % dans tous les échantillons, respectivement, à l'échelle de la somme totale (tableau supplémentaire 2). Les trois OTU des Arcobacteraceae étaient étroitement liées aux bactéries (avec une similitude de 98, 88 à 100%) observées dans le BBD dans l'océan Indo-Pacifique et la mer des Caraïbes (tableau supplémentaire 2). Six des 14 OTU (incluant l'OTU 9 représentative) chez les Arcobacteraceae étaient positivement corrélées aux taux de migration (Fig. 4a supplémentaire). Dans un placement phylogénétique des lectures courtes d'OTU, les 14 OTU étaient éloignées les unes des autres dans la famille des Arcobacteraceae dans l'arbre de référence, bien que certaines OTU aient été regroupées. Par exemple, OTU 8 et OTU 1074 regroupés dans un cluster (Fig. 4b supplémentaire). Trois OTU (OTU 27, OTU 192 et OTU 952) appartenaient au genre Malarcobacter, une OTU (OTU 144) appartenait au genre Halarcobacter et d'autres OTU ont été classées dans un groupe non cultivé (Fig. 4b supplémentaire). Bien que d'autres familles (voir plus de détails dans le tableau supplémentaire 3 et la note supplémentaire 1) n'aient montré aucune corrélation significative, comme les cyanobactéries appartenant aux désertifilaceae, elles ont eu tendance à augmenter positivement avec les taux de migration (tableau supplémentaire 3).

Le long de divers taux de migration de BBD à partir de deux emplacements (a), des graphiques à bulles montrant l'abondance bactérienne relative (représentée par la taille) des 24 principales familles, des bactéries non classées et d'autres (cette moyenne <0,5 % de cette abondance relative ont été regroupés) au total mise à l'échelle de la somme (b). Corrélations significatives entre les taux de migration et les diversités alpha (richesse OTU et indice Chao1) à partir de BBD calculées par la corrélation de rang de Spearman à l'échelle de la somme totale (c). L'ombrage gris montre les intervalles de confiance à 95 % pour la corrélation de rang de Spearman (c). Une analyse en composantes principales basée sur la transformation clr (tb-PCA) représentant les communautés bactériennes (au niveau de la famille) dans BBD (d). Les identifiants d'échantillon indiqués par « AF » et « SF » ont été collectés respectivement sur l'île d'Aka et l'île de Sesoko.

La matrice transformée par clr pour chaque famille (a : Rhodobacteraceae et b : Arcobacteraceae) a été additionnée à travers les OTU. Corrélation significative marquée par * p < 0,05 et ** p < 0,01. La zone grisée représente l'intervalle de confiance à 95 %.

Pour étudier la localisation bactérienne dans BBD à travers des taux de migration distincts, nous avons appliqué FISH pour inspecter la distribution bactérienne dans les mêmes échantillons BBD qui ont été utilisés dans l'analyse de la communauté bactérienne. Étant donné que les séquences affiliées à la famille des Arcobacteraceae ont montré des augmentations significatives avec le taux de migration (Fig. 4b), nous avons utilisé la sonde Arc9430, ainsi que la sonde bactérienne à large spectre EUB338mix31, pour cibler les Arcobacteraceae. Avant de mener le FISH, nous avons évalué la sonde nouvellement conçue qui pourrait couvrir les 14 OTU des Arcobacteraceae à l'aide d'une analyse in silico. Dix des 14 OTU, dont deux OTU représentatives (OTU 8 et OTU 9), étaient idéalement adaptées à la sonde spécifique Arc94 sur la base de l'analyse de placement phylogénétique (Fig. 4b supplémentaire).

Pour visualiser la distribution bactérienne intacte et leur localisation dans les coraux, y compris leur tissu et leur squelette, nous avons utilisé une méthode récemment établie dans laquelle FISH32 a été combiné avec une section de corail non décalcifié33. Bien qu'un signal de liaison non spécifique de la sonde FISH ait été détecté dans la région du squelette corallien (Fig. 5 supplémentaire), nous avons visualisé avec succès la localité bactérienne dans le tissu corallien et les structures squelettiques intactes (Fig. 6 supplémentaire).

De nombreux signaux de sonde EUB338mix ont indiqué une localisation bactérienne dans le tapis microbien, de la limite du tissu corallien sain à la bande noire. Pendant ce temps, les signaux de la sonde EUB338mix étaient absents ou peu nombreux dans les tissus sains. La localisation bactérienne a montré une structure stratifiée verticalement dans le tapis dominé par les cyanobactéries où les cyanobactéries recouvraient la couche supérieure, tandis que de nombreuses bactéries se propageaient autour des tissus coralliens nécrotiques et des dinoflagellés symbiotiques sous la couche cyanobactérienne (Fig. 5a). Dans des coupes en série, des assemblages et des cellules individuelles d'Arcobacteraceae ont également été observés sous la couche de cyanobactéries à l'aide de la sonde spécifique Arc94 (Fig. 5b). Alors que les assemblages bactériens des signaux EUB338mix présentaient une variété de formes individuelles (Fig. 5c), les assemblages d'Arcobacteraceae présentaient une morphologie cellulaire presque identique (bactéries en forme de bâtonnets, Fig. 5d). De plus, le schéma de distribution des Arcobacteraceae indiquait leurs associations étroites avec les tissus nécrotiques coralliens (Fig. 5d).

Micrographies confocales de fusion de la structure microbienne du tapis de BBD montrant l'autofluorescence (le bleu indique le tissu corallien et le vert indique la chlorophylle des dinoflagellés symbiotiques [Sym] et des cyanobactéries) et les bactéries hybridées avec la sonde étiquetant Cy3 (rouge) (ad). Les cyanobactéries sont représentées dans une couleur jaune qui a fusionné deux canaux d'autofluorescence de la chlorophylle et des signaux bactériens avec Cy3 (a et c). Les lignes pointillées dans a et b délimitent des régions agrandies et rapprochées (c et d). Les signaux hybrides des Arcobacteraceae montrent leurs assemblages et leurs cellules dispersées (ligne pointillée et têtes fléchées jaunes en b). Les barres d'échelle représentent 30 µm.

Pour examiner la relation entre la localité bactérienne et le taux de migration, les zones de présence bactérienne de toutes les bactéries et Arcobacteraceae ont été quantifiées spatialement dans les couches supérieure, moyenne et inférieure des tapis microbiens (chaque intervalle vertical 1 mm, Fig. 6a) et par rapport aux taux de migration. Compte tenu des observations au MEB et de l'analyse de la communauté bactérienne montrant que les cyanobactéries dominantes se trouvaient toujours dans la couche supérieure, la zone de cyanobactéries filamenteuses a été exclue de cette analyse quantitative (ci-après la "zone de toutes les bactéries" est définie comme ayant une distribution de bactéries, à l'exclusion cyanobactéries). La FISH a été réalisée à l'aide des sondes EUB338mix et Arc94 sur des coupes en série afin que les distributions des bactéries cibles puissent être comparées de manière optimale (Fig. 6b, c). La zone de détection de toutes les bactéries, qui a été mesurée avec la sonde EUB338mix, était plus grande que la zone des Arcobacteraceae, qui a été mesurée avec une sonde Arc94 spécifique (Fig. 6d). Les deux signaux FISH ont été détectés dans les trois couches à différents taux de migration (Fig. 6e – j). Dans la couche de surface, la détection de toutes les bactéries et Arcobacteraceae n'a montré aucune relation avec le taux de migration (Fig. 6e, f). Ce n'est que dans la couche intermédiaire que la surface des Arcobacteraceae a augmenté avec le taux de migration (R-carré adj. 0, 04 et valeur p <0, 05) (Fig. 6g, h). En revanche, la surface de toutes les bactéries a montré une relation significativement positive avec le taux de migration, mais uniquement dans la couche inférieure (adj. R-carré 0, 06 et valeur p <0, 05) (Fig. 6I, g).

Illustration schématique montrant trois couches (surface, milieu et fond ; chaque intervalle vertical est de 1 mm) dans les tapis BBD pour l'analyse spatiale (a). Micrographies de fusion confocales montrant la localisation bactérienne spatiale (rouge) de toutes les bactéries (b) et Arcobacteraceae (c) dans deux sections en série ; hybrides avec les sondes EUB338mix et Arc94, respectivement. Les barres d'échelle indiquent 50 µm (b et c). Diagrammes en points fusionnés avec un diagramme en boîte montrant la zone entière de toutes les détections de bactéries (à l'exception des cyanobactéries filamenteuses) et d'Arcobacteraceae dans les différents taux de migration (représentés par la couleur ; les ID d'échantillon 'AF' et 'SF' indiquent la collecte de l'île d'Aka et de l'île de Sesoko , respectivement) (d). Les lignes centrales de la boîte à moustaches représentent les valeurs médianes, les limites de la boîte sont les 25 et 75 % de l'échantillon, et les quartiles supérieur et inférieur représentés dans les barres sont 5 et 95 % de l'échantillon (d). Régressions linéaires montrant les associations entre migration et zones de présence bactérienne (toutes les bactéries [e, g, et i] et Arcobacteraceae [f, h, et j]) en surface (e et f), au milieu (g et h), et les couches inférieures (I et j). Une corrélation significative est indiquée en rouge, avec * valeur p < 0,05.

Dans cette étude, nous avons démontré avec succès que la migration (c'est-à-dire un indicateur de virulence) du tapis microbien dominé par les cyanobactéries est liée à la fois à la composition bactérienne et à la localisation spatiale en utilisant une nouvelle combinaison de profilage bactérien 16 S, de sectionnement non décalcifié et de FISH. La communauté bactérienne BBD dans cette étude, qui a montré un modèle de migration unique en tant que biofilm en forme de bande, était composée de groupes qui sont devenus moins diversifiés à mesure que le taux de migration augmentait. Dans l'analyse de la communauté bactérienne, nous avons également constaté que les abondances relatives des familles Rhodobacteraceae et Arcobacteraceae avaient des corrélations négatives et positives avec les taux de migration BBD, respectivement. De plus, à mesure que le taux de migration des BBD augmentait, la population d'Arcobacteraceae augmentait de manière significative dans la couche intermédiaire, tandis que toutes les populations non cyanobactériennes augmentaient dans la couche inférieure.

Arcobacteraceae a récemment été proposée comme nouvelle famille (dans l'ordre Campylobacterales, la classe Campylobacteria et le phylum Campylobacterota) du genre Arcobacter dans Phylum Epsilonproteobacteria34. Par la suite, six genres nommés ont été proposés et déplacés du genre original Arcobacter dans Arcobacteraceae35. Cependant, récemment, une nouvelle proposition faite par On et al. a de nouveau reclassé les genres de la famille des Arcobacteraceae dans le seul genre Arcobacter36. Nos résultats suggèrent que les Arcobacteraceae (= Arcobacter sensu lato34,35,36) sont profondément impliquées dans la pathogénicité de la BBD. La présence d'Arcobacter dans le BBD a été fréquemment signalée dans un large éventail de régions géographiques des Caraïbes, de l'Indo-Pacifique et de la mer Rouge28,29,37,38. Les Arcobacteraceae sont, en général, aérotolérantes, psychrotrophes36 et omniprésentes dans les environnements et les animaux39. Compte tenu de la condition oxique spatialement (en particulier verticalement) et temporellement hétérogène au sein du tapis BBD40, notre découverte selon laquelle les populations d'Arcobacteraceae sont apparues dans toutes les couches de BBD avec des taux de migration faibles à élevés suggère que les Arcobacteraceae associées au BBD sont aérotolérantes.

Un membre d'Arcobacteraceae isolé d'environnements marins a été identifié comme oxydant de sulfure autotrophe ou chimiolithohétérotrophe par des analyses in vitro et in silico41,42,43. Dans une étude précédente sur le BBD, l'abondance relative des Rhodobacteraceae a diminué au cours de la transition du développement du BBD à partir du précurseur du BBD, appelé « patch cyanobactérien » (CP), qui a progressé à un rythme plus lent, alors que l'abondance relative d'Arcobacter spp. augmenté à mesure que BBD se développait avec une virulence accrue20. La contribution des Rhodobacterales dans le BBD a été confirmée par le profilage à l'aide d'un gène fonctionnel clé (soxB) pour l'oxydation des sulfures dans le BBD. Cependant, l'abondance relative des gènes soxB affiliés aux Rhodobacterales a augmenté davantage dans le tapis BBD par rapport à CP17. Les gènes soxB dérivés d'Arcobacter n'ont pas été détectés, vraisemblablement parce que les amorces universelles pour les gènes soxB sont incapables d'identifier des séquences du genre Arcobacter44. En fait, une étude de séquençage du métagénome shotgun, exempte de biais PCR, a rapporté Arcobacter comme des membres majeurs de SOB dans BBD38. Pris ensemble, il existe une forte possibilité qu'Arcobacter joue un rôle dans l'étape d'oxydation des sulfures du cycle du soufre dans le consortium BBD. De plus, étant donné que l'Arcobacter oxydant le soufre est très résistant au sulfure d'hydrogène élevé et aux faibles niveaux d'oxygène et qu'il entre donc efficacement en compétition avec d'autres SOB co-occurrents45, nos résultats indiquent qu'une niche fonctionnelle de l'oxydation du sulfure dans le BBD peut avoir été transférée des Rhodobacteraceae aux Arcobacteraceae à mesure que la virulence BBD augmentait.

Nos résultats de FISH ont montré que la population d'Arcobacteraceae, en particulier dans la couche médiane du tapis BBD, était légèrement mais positivement corrélée avec les taux de migration. Bien que les distributions chimiques verticales du sulfure d'hydrogène et de l'oxygène varient dynamiquement dans le tapis BBD du jour (faible teneur en sulfure d'hydrogène et en oxygène diminue verticalement avec la profondeur du tapis) à la nuit (le sulfure d'hydrogène augmente verticalement et le tapis devient entièrement anoxique)40, Arcobacter pourrait être capable de médier dans n'importe quelle condition et de maintenir leur abondance46. De plus, un membre d'Arcobacter (Candidatus A. sulfidicus) a été signalé comme un microaérophile très mobile, ce qui semble être typique des organismes vivant aux interfaces oxique-anoxique45. Compte tenu de l'état chimique du BBD le jour40 où nous avons collecté des échantillons, la couche intermédiaire du tapis BBD pourrait permettre aux Arcobacteraceae de proliférer et de s'adapter aux conditions environnementales, y compris les niveaux de sulfure d'hydrogène et d'oxygène, et fournir simultanément le sulfate pour le SRB par le sulfure l'oxydation et jouer un rôle dans la promotion ou la modification de la migration du consortium qui pourrait être associée à la virulence BBD. De plus, étant donné que le genre Arcobacter possède également l'ensemble complet de gènes responsables de la réduction assimilatrice des sulfates selon la prédiction du génome entier46, de futures études sont nécessaires pour confirmer le rôle des Arcobacteraceae non seulement dans l'oxydation des sulfures mais aussi dans la réduction des sulfates dans le tapis BBD.

Les Arcobacteraceae du BBD pourraient également se comporter comme des agents pathogènes qui altèrent directement les tissus coralliens. Arcobacter a également été abondamment détecté dans les lésions de nombreuses maladies coralliennes autres que la DBB, telles que la variole blanche47, le syndrome blanc48, la maladie de la bande brune48 et la maladie de perte de tissu corallien pierreux49 dans les récifs coralliens du monde. Des essais in vitro de cultures de cellules humaines et animales ont montré qu'Arcobacter a une virulence significative en ce qui concerne la formation de colonies et l'établissement d'infections dans les tissus hôtes50,51, et il est également connu que la plupart des Arcobacter sont équipés de gènes de virulence tels que ciaB, irgA , et cadF52,53. Par conséquent, la présence d'Arcobacter pathogène dans les organismes marins justifie des recherches plus approfondies.

Les biofilms ont été impliqués dans de nombreuses infections cliniques et les preuves accumulées montrent que les biofilms contribuent à la pathogenèse, en particulier les infections chroniques54 et la plaque buccale55. Parmi les biofilms pathogènes, les systèmes les plus étudiés comprennent la plaque buccale humaine. Après une clairance partielle du biofilm polymicrobien par élimination physique, le cycle de colonisation se répète dans la même transition successionnelle spatio-temporelle générale jusqu'à ce qu'une communauté mature de microbes soit repeuplée56. Au cours de la transition, la colonisation bactérienne précoce et la composition varient selon les individus, mais les genres les plus abondants sont généralement conservés. On pense souvent que des changements brusques ou subtils dans la composition bactérienne favorisent les phénotypes associés à la maladie57. Des associations polymicrobiennes spécifiques dans la parodontite humaine peuvent exacerber la gravité et la progression de la maladie57. Dans la BBD, la diversité bactérienne alpha s'est avérée négativement corrélée avec la migration. Des études antérieures ont montré que la BBD et la CP non actives (tache cyanobactérienne) sont associées à une diversité bactérienne élevée et à des taux de migration non migratoire et faible, respectivement20,29. Le résultat FISH a montré une légère augmentation de la population bactérienne ainsi qu'un taux de migration croissant et pourrait suggérer que le consortium bactérien BBD pourrait être élaboré avec une faible diversité proliférant dans des tapis BBD individuels. Cependant, la variation des taux de migration du BBD n'a pas pu être liée aux communautés bactériennes spécifiques qui sont apparues dans le BBD avec un taux de migration élevé. En effet, la famille bactérienne Vibrionaceae, qui comprend certaines espèces connues pour être des pathogènes coralliens58,59, est apparue quel que soit le gradient de migration (Fig. 2b). Néanmoins, une tendance à la diminution des Rhodobacteraceae et à l'augmentation des Arcobacteraceae chez les BBD avec un taux de migration élevé a certainement été confirmée.

Dans l'expérience FISH, les bactéries du tapis microbien BBD ont montré des modèles de distribution spatiale avec divers taux de migration. Outre la population d'Arcobacteraceae, toutes les populations bactériennes de la couche inférieure ont montré une faible corrélation positive avec le taux de migration de la BBD. Combinée aux résultats de la communauté bactérienne, notre visualisation microbienne a suggéré que la structure de la communauté bactérienne liée à la virulence élevée de la BBD se développe sous une forte sélection qui exclut les autres bactéries, en particulier dans la couche inférieure. Dans la couche inférieure du BBD, où des conditions faibles en oxygène ou anoxiques sont anticipées, même pendant la journée15, une niche pourrait éventuellement être fournie à la fois aux SRB et aux hétérotrophes anaérobies.

Cette étude démontre pour la première fois la corrélation entre les changements de composition bactérienne/localisation spatiale et le taux de migration du BBD, en particulier du BBD dans le corail de Montipora. En bref, cette étude fournit de nouvelles informations sur la dynamique microbienne de la BBD et indique que le modèle de pathogenèse médiée par les microbes dans la BBD est plus compliqué qu'on ne le pensait auparavant. Cependant, nos résultats indiquent que les Arcobacteraceae pourraient être l'un des fondements clés de la structure de la communauté bactérienne de la BBD virulente. Compte tenu de la corrélation positive entre les Arcobacteraceae et la virulence BBD, nous proposons que les Arcobacteraceae soient un biomarqueur potentiel de la virulence BBD. Ces résultats devraient être testés dans d'autres taxons coralliens divers, car de nombreuses espèces sont connues pour être affectées par la DBB. En outre, nous encourageons davantage de recherches sur d'autres maladies coralliennes en utilisant notre nouvelle combinaison de communauté bactérienne et de FISH avec des techniques de sectionnement non décalcifiées pour révéler la composition bactérienne/localisation spatiale intacte ainsi que la virulence des maladies coralliennes.

Cette étude a été menée sur deux récifs près de l'île de Sesoko (26°38′35.2″N, 127°51′49.5″E) et de l'île d'Aka (26°12′00.0″N, 127°16′45.0″E) à Okinawa, Japon (Fig. 1 supplémentaire). Les sites sont situés à environ 70 km l'un de l'autre et sont en pleine mer entre eux. Un total de 38 colonies de Montipora encroûtantes infectées par la BBD ont été mesurées pour les taux de migration linéaire à l'été 2014 (n = 9 dans chaque emplacement) et 2015 (n = 10 dans chaque emplacement). Pour déterminer le taux de migration linéaire de BBD dans chaque colonie individuelle, des photographies ont été prises de l'avant de la lésion BBD sur une région plate de la colonie, à la fois trois jours avant l'échantillonnage et le jour de l'échantillonnage. Les taux moyens de migration linéaire (mm/jour) de BBD en tant que variable dans les modèles ci-dessous ont été calculés à cinq points aléatoires sur la région de chaque colonie à l'aide du logiciel Fiji60. Nous avons également mesuré les profondeurs de chaque colonie infectée par la BBD et enregistré la température de l'eau (avec des intervalles d'une heure) à l'aide d'un enregistreur Onset HOBO Pendant logger® pendant l'observation. Pour évaluer la corrélation entre le taux de migration et la profondeur, la corrélation de rang de Spearman a été réalisée à l'aide du logiciel de statistiques R v4.0.261. La comparaison de la variance des taux de migration entre les lieux et les années a également été vérifiée par une analyse unidirectionnelle de la variance (ANOVA unidirectionnelle) à l'aide du logiciel de statistiques R v4.0.261.

Pour les analyses en aval, les échantillons des 18 colonies en 2014 et 12 des 20 colonies en 2015 (n = 6 de chaque emplacement) ont été obtenus pour l'observation au microscope électronique à balayage (SEM) et l'analyse combinée de la communauté bactérienne et FISH, respectivement. Chaque échantillon (un échantillon par colonie individuelle) de la région BBD contenant des tissus et un squelette sains (environ 3 à 4 cm de longueur et de largeur et un cm de profondeur) a été coupé à l'aide d'un marteau et d'un ciseau à l'endroit où la migration linéaire les taux ont été mesurés. Pour le SEM, les échantillons ont été coupés en un carré d'environ 1 cm, immédiatement fixés par du glutaraldéhyde (GA) à 2 % dans une solution saline tamponnée au phosphate 10 mM (PBS, pH 7,4) sur de la glace, et stockés séquentiellement à 4 °C. Pour l'analyse de la communauté bactérienne et l'analyse combinée FISH, les échantillons ont été coupés en deux morceaux d'environ 2 cm chacun. Un échantillon a été découpé de la bande noire par un poinçon en cuir stérilisé (diamètre de cercle de 4 mm) et la bande a été stockée dans 300 µl d'éthanol à 100 % à -80 °C pour analyse de la communauté bactérienne. Le deuxième échantillon (environ un carré de 2 cm) a été immédiatement fixé dans du paraformaldéhyde (PFA) à 4 % dans du PBS (Wako, Japon) à 4 °C pendant 8 h, rincé trois fois avec de l'éthanol à 70 % et stocké dans de l'éthanol à 70 % à 4 °C pour FISH ci-dessous.

Les échantillons fixés au GA (n = 18) ont été doucement rincés dans du PBS pendant 15 min trois fois et déshydratés dans une série de gradients éthanol/eau (20, 40, 60, 70, 90 et 100 % une fois, et éthanol abs. trois fois) pendant 20 min chacun à température ambiante. Des échantillons déshydratés fixés au GA ont été immergés dans de l'abs. série graduée éthanol / alcool t-butylique (7: 3 et 1: 1 pendant 15 min chacun), transféré dans de l'alcool t-butylique à une température supérieure à 25,5 ° C pendant 60 min et placé au réfrigérateur après avoir remplacé l'ancien alcool t-butylique avec de l'alcool neuf. Les échantillons ont été séchés à l'aide d'un dispositif de lyophilisation (VFD-21S, SHINKKU VD, Japon) pendant 3 h et recouverts d'un alliage platine/palladium en pulvérisation ionique (E-1010, HITACHI, Japon). L'observation et l'acquisition d'images ont été réalisées par une microscopie électronique à balayage (SEMS-3500N, HITACHI, Japon). Nous avons observé les micro-organismes dans la surface à moins de 1 mm de la frontière avec du tissu corallien sain jusqu'aux tapis BBD, et avons déterminé la présence ou l'absence de micro-organismes en les photographiant au hasard. Un total de 42 images (6 images à un grossissement de 100x, 18 images à un grossissement de 1000x et 18 images à un grossissement de 2000x) ont été prises à partir de chaque lésion BBD.

Les échantillons perforés à la BBD (n = 12) dans 300 µl d'éthanol à 100 %, ont été directement ajoutés à 120 µl d'eau sans nucléotide et 12 µl d'acétate de sodium 3 M, mélangés au vortex et stockés à -20 °C pendant 45 heures. min. Après une centrifugation à 18 000 × g pendant 20 min, le culot a été remis en suspension dans 300 µl d'éthanol à 70 % prérefroidi, centrifugé à nouveau dans les mêmes conditions ci-dessus, retiré de la solution et séché. L'ADN génomique a été extrait du culot par le kit DNeasy Blood & Tissue (Qiagen), qui comprenait l'ajout d'une étape de lyse enzymatique à base de lysozyme (tampon : 20 mg/ml de lysozyme, 20 mM de Tris-HCl [pH 8,0], 2 mM EDTA [pH 8,0] et 1,2 % de Triton X-100) selon le protocole du fabricant.

L'ADN génomique a été utilisé comme matrice pour l'amplification de la région V4 du gène de l'ARNr 16 S bactérien à l'aide du jeu d'amorces universel (515 F et 806 R, tableau supplémentaire 4) et de la procédure de PCR suivante : 35 cycles de 30 sec à 95 ° C (dénaturation), 30 s à 51 °C (hybridation), 30 s à 72 °C (extension), suivies d'une extension supplémentaire de 5 min à 72 °C. Ensuite, des séquences d'index ont été ajoutées par PCR à l'aide du kit d'index Nextera XT (Illumina, US). Les amplicons ont été envoyés pour séquençage avec une chimie de lecture appariée par un séquenceur MiSeq (Illumina, US). Les lectures de séquençage sont résumées dans le tableau supplémentaire 5.

Les lectures appariées de chaque échantillon ont été fusionnées dans le logiciel QiimeI à l'aide de MacQIIME v.1.9162. Les séquences fusionnées obtenues ont été filtrées dans le logiciel MOTHUR v.1.39.563 en utilisant les critères suivants : (1) longueurs de lecture entre 249 et 256 pb ; (2) score de qualité de lecture moyen de 27 ; et (3) longueur de lecture de l'homopolymère < 8 pb. Nous avons en outre détecté des séquences chimériques à l'aide de l'algorithme USEARCH v.11.0.66764 et avons ensuite exclu les séquences chimériques. Nous avons implémenté USEARCH avec un seuil de similarité de 97 % avec les OTU en cluster. Les OTU ont été attribuées à des groupes taxonomiques connus par cartographie sur la base de données Silva SSU r138.165 en utilisant le MOTHUR avec une valeur seuil de 80. Après avoir retiré les séquences d'Eukaryota, d'Archaea, d'inconnu et de chloroplaste, un total de 1 593 OTU bactériennes ont été attribuées à 255 familles (1401 OTU), bactéries non classées (151 OTU), bactéries non cultivées (31 OTU dans 10 ordres), familles non cultivées (quatre OTU dans trois classes) et familles inconnues (six OTU dans deux ordres).

Les analyses statistiques de l'ensemble de données de la communauté bactérienne ont été effectuées à l'aide du logiciel de statistiques R v4.0.261, incorporant le package R phyloseq v.1.34.066 et vegan v. 2.5–767. Les indices de diversité alpha (richesse OTU et Chao1) ont été calculés à l'aide de la fonction "estimate_richness" dans le phyloseq, et la corrélation le long des taux de migration utilisait la corrélation de rang de Spearman dans le logiciel de statistiques R v4.0.261. Pour l'analyse de la diversité bêta, les données phyloseq au niveau de la famille ont été transformées à l'aide de la fonction de transformation Centered Log Ratio (clr) dans un package R microbiome v. 1.12.068, et une matrice de distance a été calculée à l'aide de la distance euclidienne avec la fonction "distance" de le package R phyloseq. L'analyse en composantes principales basée sur la transformation (tb-PCA) a été visualisée avec la fonction "ordonnée" du package R phyloseq. Pour évaluer l'impact des différences de localisation et de profondeur d'échantillonnage sur les données de composition, un test d'analyse de variance permutationnelle multivariée (PERMANOVA) a été réalisé à l'aide de la fonction "adonis2" du package R vegan. Pour évaluer la corrélation entre la différence des taux de migration et la différence de composition de la communauté bactérienne, le taux de migration a été converti en une matrice de distance avec distance euclidienne à l'aide de la fonction "dist" dans le logiciel de statistiques R, et un test de Mantel a été appliqué à la matrice de distance transformée par clr de la structure bactérienne et aux matrices de distance de migration dans le package R vegan (corrélation de rang de Spearman et 999 permutations). Par la suite, une analyse de corrélation partielle a été déterminée à l'aide de la matrice de transformation clr de chaque famille bactérienne représentative et du taux de migration linéaire BBD calculé à l'aide du test de corrélation de rang de Spearman dans le logiciel de statistiques R.

De plus, les OTU représentatives (montrant > 1 % à l'échelle de la somme totale) ont été soumises à des recherches BLAST de nucléotide-nucléotide pour identifier leurs plus proches parents dans la base de données GenBank (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast. cgi). Les séquences les plus proches ont été choisies par similarité élevée et position de lignage dans blastn (collection de nucléotides nr/nt) et la fonction "Blast Tree View (méthode Tree : Fast Minimum Evolution and Max Seq Differences : 0,75)". Lorsque les résultats atteignaient plusieurs séquences, nous avons sélectionné celles provenant de sources liées à la BBD, à la maladie des coraux et aux coraux sains.

Selon l'analyse de corrélation partielle, la famille des Arcobacteraceae comprenait 14 OTU positivement corrélées avec la migration de la BBD. Par conséquent, nous avons effectué FISH sur 12 échantillons en utilisant les sondes spécifiques, EUB338mix31,69 pour la plupart des bactéries et Arc9430 pour Arcobacteraceae (tableau supplémentaire 4), avec une méthode de coupe mince non décalcifiée, après avoir estimé la spécificité de la sonde pour les 14 OTU.

Pour estimer la spécificité de la sonde pour les 14 OTU d'Arcobacteraceae, 653 séquences de référence attribuées à la famille Arcobacteraceae composée des genres Arcobacter, Malaciobacter, Halarcobacter, Pseudarcobacter, Poseidonibacter et Arcobacteraceae non cultivées ont été extraites de la base de données Silva SSU r13865. Les séquences de référence ont également été testées pour la correspondance avec la sonde Arc9430 pour Arcobacter à l'aide de TestProbe 3.0 (https://www.arb-silva.de/search/testprobe/), et la sonde a estimé une couverture d'Arcobacteraceae à 78,0 % (509 sur de 653 séquences de référence). Pour la construction de l'arbre de référence, les séquences de référence ont été alignées à l'aide du logiciel infernal v.1.1.370 et un arbre à maximum de vraisemblance a été construit dans RAxML-NG v.1.0.271 avec le modèle GTR+G et 200 répliques bootstrap. Ensuite, 14 séquences OTU ont été alignées sur l'alignement de séquences multiples de référence à l'aide du programme PaPaRa core v.2.572, puis placées avec le score d'estimation le plus élevé (like_weight_ratio) sur l'arbre de référence par le logiciel EPA-ng v.0.3.673, puis l'arbre a été visualisé à l'aide de l'arbre de vie interactif (iTOL) v.474 pour l'évaluation de la spécificité de la sonde. Les emplacements phylogénétiques de la séquence OTU ont été estimés par EPA-ng sur l'arbre de référence et définis avec un score élevé de "like_weight_ratio", lorsque l'algorithme calcule plusieurs emplacements sur l'arbre de référence (le score défini dans la plage de 0,15 à 0,99) .

Les échantillons fixés au PFA dans de l'éthanol à 70 % ont été placés dans du PBS contenant 10 % de saccharose pendant 1 h à 4 °C et transférés dans du saccharose à 20 % pendant une nuit à 4 °C. Les échantillons fixés au PFA ont ensuite été intégrés dans le composé d'enrobage (SCEM, SECTION LAB Co. Ltd, Japon) et immergés dans un mélange de neige carbonique et d'hexane jusqu'à ce qu'ils soient complètement congelés. La coupe non décalcifiée attachée au film adhésif33 a été réalisée pour obtenir trois coupes en série à partir des échantillons fixés au PFA pour des spécimens de corail de 5 µm d'épaisseur avec une lame en carbure de tungstène (SL-T30, SECTION LAB Co. Ltd., Japon) à l'aide d'un cryostat système (Leica CM1850, Allemagne). Les sections non décalcifiées attachées au film adhésif ont été immergées dans de l'éthanol à 100 % pendant 30 secondes pour éliminer le composé et séchées à l'air. La FISH a été réalisée comme décrit dans Wada et al.32 avec de légères modifications, y compris une étape sans déparaffinage et une étape sans immersion avec une solution de HCl. En d'autres termes, les coupes séchées à l'air ont été lavées dans une solution de Tris-HCl 20 mM (pH 8,0) pendant 10 min à température ambiante, montées dans une protéinase K (50 µg/ml) avec la solution de Tris-HCl 20 mM pour 5 min à 37 ° C, et rincé dans la solution Tris-HCl 20 mM avant l'hybridation. Chaque section en série a effectué une hybridation de sondes à l'aide de trois sondes marquées avec le fluorochrome Cy3 : (1) EUB338mix31,69, (2) Non33875 dans un tampon d'hybridation (0,9 M NaCl, 20 mM Tris-HCl et 0,01 % de SDS) contenant 30 % de formamide et (3) Arc9430 à 20 % de formamide (tableau supplémentaire 4) à 46 °C pendant 1,5 h. Chaque section hybridée a été lavée dans des tampons de lavage (Tris-HCl 20 mM, SDS 0,01 %, EDTA 5 mM (pH 8,0) et NaCl (0,112 M pour les traitements par sonde EUB338mix et Non338 et 0,225 M pour le traitement par sonde Arc94)) à 48 ° C pendant 10 min. Les sections lavées attachées au film adhésif ont été lavées à l'eau froide et séchées à l'air, recueillies sur une lame de verre (S2441, MATSUNAMI), puis une lamelle a été montée sur la lame dans une solution antifade (Fluoromount/Plus, Diagnostic BioSystems) .

L'acquisition des images a été réalisée avec une lentille d'objectif à grossissement 40x (HC PL APO 40x/1,30 OIL CS2) dans un microscope confocal (TCS SP8, Leica). Le fluorochrome Cy3 et la chlorophylle (pour les Symbiodiniaceae et les cyanobactéries) ont été excités à 552 nm (2,0 %) et détectés dans une plage d'émission de 571–582 nm avec HyD (mode standard et gain 100) et de 650–696 nm avec PMT (gain 700 ). L'autofluorescence de corail a également été excitée à 405 nm (1, 5%) et détectée dans une plage d'émission de 460 à 510 nm avec HyD (mode standard et gain 161). Afin d'analyser quantitativement la zone de présence de bactéries, six images (chaque taille 1024 × 1024 pixels) ont été acquises à partir de chacune des trois régions de la section transversale BBD : couches supérieure, moyenne et inférieure (chaque intervalle vertical 1 mm , figure 6a). Les signaux de fluorescence délimités par chaque sonde (EUB338mix et Arc94) ont été identifiés avec des signaux spécifiques ou des liaisons de sonde non spécifiques (en utilisant la sonde Non338), selon les critères détaillés par Wada et al.32.

Le traitement des images a été effectué à l'aide du logiciel Fiji60 après avoir exporté les images du fluorochrome Cy3 et de la chlorophylle vers des images TIFF en niveaux de gris 8 bits à l'aide du logiciel LAS X (Leica). Chaque image en niveaux de gris a été convertie en une image binaire par une fonction de seuillage utilisant l'algorithme "Max entropy"76. Pour analyser la présence de bactéries autres que les cyanobactéries dans le signal Cy3 de la sonde EUB338mix, la région des cyanobactéries dans le signal de chlorophylle a été soustraite de l'image binaire du signal EUB338mix par la fonction "subtract" et curation manuelle. L'image binaire a été filtrée pour réduire le bruit par la fonction "Remove Outliers" (Rayon 1.5 et seuil 50). De plus, étant donné que les signaux du canal du fluorochrome Cy3 contenaient également une fluorescence non spécifique des régions du squelette (Fig. 5 supplémentaire), la fluorescence des régions du squelette a été supprimée manuellement de l'image binaire. Sur la base des images binaires, les surfaces de bactéries totales, à l'exception des cyanobactéries et des Arcobacteraceae, ont été calculées en pixels (reflétant la taille de leur population en termes de biomasse). La relation entre chaque zone des trois couches et le taux de migration linéaire BBD a été mesurée à l'aide d'un modèle de régression linéaire (une fonction "lm") dans le logiciel de statistiques R v4.0.261.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Toutes les données de séquençage produites dans cette étude ont été soumises au DDBJ Read Archive sous le numéro d'accession DRA010783.

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Cette recherche a été soutenue par Grant-in-Aid for JSPS Fellows DC1 26•6085, et un financement de l'Academia Sinica. NW remercie aimablement le Dr Kataaki Okubo, le Dr Yukika Kawabata-Sakata et le regretté M. Kiyoshi Nakasone pour le soutien technique en imagerie au microscope confocal et pour encourager la motivation de NW pour son doctorat. NW remercie également feu son père et sa mère pour lui avoir ouvert des portes d'opportunités de recherche. NW espère sincèrement que leur voyage se passe bien au paradis.

Ces auteurs ont conjointement supervisé ce travail : Sen-Lin Tang, Nobuhiro Mano.

Centre de recherche sur la biodiversité, Academia Sinica, No.128, Sec 2, Academia Rd, Nangang, Taipei, 11529, Taïwan

Naohisa Wada & Sen-Lin Tang

Département des sciences et des ressources marines, Collège des sciences des bioressources, Université Nihon, Fujisawa, Kanagawa, 252-0813, Japon

Naohisa Wada, Yuta Urabe, Natsumi Abe, Kazuki Takase, Shuji Hayashi, Saeko Kawanabe et Nobuhiro Mano

Service géologique du Japon, Institut national des sciences et technologies industrielles avancées (AIST), 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, 305-8567, Japon

Akira Iguchi

Laboratoire de recherche sur les développements et technologies respectueux de l'environnement [E-code], Institut national des sciences et technologies industrielles avancées (AIST), Tsukuba, 305-8567, Japon

Akira Iguchi

Département de génie des bioressources, Institut national de technologie, Okinawa College, 905 Henoko, Nago-City, Okinawa, 905-2192, Japon

Yuki Yoshioka

Collège des sciences et de l'ingénierie, Université James Cook, Townsville, Queensland, 4811, Australie

Yui Sato

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NW et NM ont conçu l'étude. NW, YU, NA, KT, SH et SK ont effectué l'échantillonnage sur le terrain, y compris la mesure du taux de migration de BBD. NW et YU ont effectué l'observation SEM. NW, AI et YY ont effectué un traitement moléculaire et une analyse bioinformatique et statistique des données de séquence. NW a réalisé le travail histologique, l'observation FISH et l'analyse statistique. NW et S.-LT ont eu une contribution majeure dans la rédaction du manuscrit et la fabrication des figures. AI, YS et NM ont contribué à la rédaction et à la révision du manuscrit. S.-LT et NM sont co-auteurs correspondants du manuscrit. Tous les auteurs ont fait l'objet d'un examen critique.

Correspondance avec Sen-Lin Tang ou Nobuhiro Mano.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Wada, N., Iguchi, A., Urabe, Y. et al. La composition des tapis microbiens et les schémas de localisation expliquent la virulence de la maladie des bandes noires chez les coraux. npj Biofilms Microbiomes 9, 15 (2023). https://doi.org/10.1038/s41522-023-00381-9

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Reçu : 06 octobre 2022

Accepté : 13 mars 2023

Publié: 04 avril 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41522-023-00381-9

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