L'inhibition pharmacologique de HDAC6 améliore les phénotypes musculaires dans la dystrophine

Nature Communications volume 13, Numéro d'article : 7108 (2022) Citer cet article

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L'absence de dystrophine dans la dystrophine musculaire de Duchenne perturbe le complexe glycoprotéique associé à la dystrophine entraînant une fragilité et une atrophie des fibres musculaires squelettiques, associées à une fibrose ainsi qu'à une désorganisation des microtubules et des jonctions neuromusculaires. Il a récemment été démontré que l'histone désacétylase 6 cytoplasmique spécifique et non conventionnelle (HDAC6) régule la distribution des récepteurs de l'acétylcholine et l'atrophie musculaire. Nous rapportons ici que l'administration de l'inhibiteur sélectif HDAC6 tubastatine A à la dystrophie musculaire de Duchenne, le modèle de souris mdx augmente la force musculaire, améliore les microtubules, la jonction neuromusculaire et l'organisation du complexe glycoprotéique associé à la dystrophine, et réduit l'atrophie musculaire et la fibrose. Fait intéressant, nous avons constaté que les effets bénéfiques de l'inhibition de HDAC6 impliquent la régulation à la baisse de la signalisation bêta du facteur de croissance transformant. En augmentant l'acétylation de Smad3 dans le cytoplasme, l'inhibition de HDAC6 réduit la phosphorylation de Smad2/3, la translocation nucléaire et l'activité transcriptionnelle. Ces résultats fournissent des preuves in vivo que Smad3 est une nouvelle cible de HDAC6 et impliquent HDAC6 comme cible thérapeutique potentielle dans la dystrophie musculaire de Duchenne.

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie neuromusculaire récessive liée à l'X affectant environ 1 nouveau-né de sexe masculin sur 3500 dans le monde et est la forme la plus courante et mortelle de dystrophie musculaire1,2. Les patients atteints de DMD manifestent leurs premiers symptômes cliniques à l'âge de 3 à 4 ans et deviennent dépendants d'un fauteuil roulant entre 7 et 13 ans. La période de marche peut être prolongée chez de nombreux garçons atteints de DMD avec une initiation précoce du traitement aux stéroïdes. Le stade terminal de la maladie commence lorsque les patients ont besoin d'une ventilation assistée avant l'âge de 20 ans et les patients meurent généralement dans leur troisième ou quatrième décennie en raison d'une insuffisance respiratoire ou cardiaque3,4,5,6,7. La DMD résulte de mutations du gène de la dystrophine qui provoquent la synthèse de dystrophine non fonctionnelle ou son absence totale. La dystrophine est un composant essentiel du complexe glycoprotéique associé à la dystrophine (DGC) dans le muscle8. Le DGC est une structure qui s'étend sur le sarcolemme et forme un lien mécanique entre le cytosquelette interne et la matrice extracellulaire via l'association de la dystrophine avec les cytosquelettes d'actine et de microtubules et la liaison du dystroglycane à la laminine dans la lame basale, respectivement9,10. Lors de la contraction musculaire, le DGC agit comme un amortisseur moléculaire et stabilise la membrane plasmique11,12. La perte de dystrophine est associée à la perte du DGC et s'ensuit une détérioration et une dégénérescence musculaire empêchant ainsi le DGC d'exercer ses fonctions. Cela rend les fibres musculaires plus sensibles aux dommages membranaires induits par la contraction, entraînant la mort cellulaire13,14,15,16. Ce processus pathologique s'accompagne d'inflammation et de fibrose qui participent à la fonte musculaire et à la perte de fonction17,18,19,20,21.

Malgré d'énormes efforts de recherche, aucun remède n'est encore disponible pour les patients atteints de DMD. Des stratégies thérapeutiques basées sur les gènes, telles que le saut d'exon, la suppression des codons stop, l'administration de mini-dystrophine médiée par le virus adéno-associé (AAV) ou l'édition de gènes CRISPR/Cas9 sont activement étudiées pour traiter la DMD22,23. En parallèle, des traitements pharmacologiques sont également développés24,25,26,27. De telles approches agissent sur des voies de signalisation et des événements cellulaires spécifiques, y compris ceux qui peuvent provoquer une régulation positive de l'utrophine A28,29,30. Néanmoins, les glucocorticoïdes constituent toujours le traitement de référence, agissant principalement comme anti-inflammatoires31. Avec l'utilisation des stéroïdes et la prise en charge multidisciplinaire, notamment la ventilation mécanique, l'espérance de vie des patients DMD s'est considérablement allongée et les individus atteints peuvent désormais atteindre 30 à 40 ans.

La signalisation TGF-β joue un rôle central dans la promotion de l'atrophie musculaire et de la fibrose dans les troubles neuromusculaires. Une variété de ligands, dont GDF8/myostatine, GDF11 et les activines, se lient aux récepteurs TGF-β de type II et déclenchent la phosphorylation des facteurs de transcription Smad2 et Smad3 lors de l'activation. La phosphorylation de Smad2/3 permet l'oligomérisation avec Smad4 et la translocation dans le noyau pour activer l'expression de gènes impliqués dans l'atrophie musculaire en coopération avec les facteurs de transcription FoxO32,33,34. L'inhibition de Smad2 et Smad3 est suffisante pour induire la croissance musculaire et l'expression constitutive de Smad3 déclenche l'atrophie musculaire35,36. Fait intéressant, des travaux antérieurs ont montré qu'il existe une diaphonie entre la signalisation TGF-β et mTOR. En effet, la myostatine/GDF8 inhibe la signalisation Akt/mTOR via une augmentation induite par Smad3 de la traduction de PTEN37. Dans l'ensemble, il semble que la signalisation TGF-β soit une cible pharmacologique attrayante pour prévenir l'atrophie musculaire. Ces thérapies à base de médicaments pourraient avoir des avantages significatifs pour les conditions atrophiques, notamment plusieurs maladies neuromusculaires, la cachexie et la sarcopénie.

HDAC6 est un membre cytoplasmique unique de la famille des histones désacétylases (HDAC), appartenant à la classe IIb HDAC38,39. HDAC6 désacétyle plusieurs substrats cytoplasmiques tels que l'α-tubuline, la cortactine et HSP90, tandis que d'autres HDAC sont généralement des régulateurs centraux de l'expression génique. En effet, les HDAC classiques telles que HDAC4 et HDAC5, sont impliquées dans la régulation des atrogènes via les facteurs de transcription Myogenin et Foxo340,41. Dans ce contexte, nous avons précédemment montré que HDAC6 est un atrogène activé par FoxO3a qui peut interagir avec l'ubiquitine ligase atrogin1/MAFbx42. Des efforts considérables pour développer des inhibiteurs HDAC6 spécifiques ont été faits pour traiter une variété de maladies. En particulier, plusieurs traitements anticancéreux ciblant HDAC6 ont été proposés43,44. De plus, la suppression ou l'inhibition de HDAC6 s'est avérée bénéfique pour certains troubles neurodégénératifs, notamment la sclérose latérale amyotrophique (SLA) et la maladie de Charcot-Marie-Tooth45,46,47. L'inhibiteur d'HDAC, la tubastatine A (TubA) se distingue comme un inhibiteur d'HDAC6 hautement sélectif. En effet, TubA inhibe efficacement et spécifiquement l'activité HDAC6 désacétylase avec une IC50 de 15 nM et une sélectivité stricte pour HDAC6 sur toutes les autres HDAC (plus de 1000 fois), sauf pour HDAC8 (57 fois)46,48,49. TubA est connu pour inhiber l'expression du collagène de type 1 induite par le TGF-β dans les fibroblastes pulmonaires50,51 et des rapports antérieurs ont montré que le TGF-β augmente l'activité de l'HDAC650,52. En effet, Smad7 régule l'expression de HDAC6 dans le cancer de la prostate en réponse au TGF-β53 et HDAC6 peut jouer un rôle indispensable dans l'équilibrage du maintien et de l'activation des follicules primordiaux via la signalisation mécaniste de la rapamycine (mTOR) chez la souris54,55.

Des travaux antérieurs avec des inhibiteurs pan-HDAC ont montré que l'inhibition de l'HDAC améliore le phénotype dystrophique27,56. Cependant, il reste actuellement difficile de savoir quel HDAC est impliqué dans cet effet bénéfique. Dans une étude récente, nous avons découvert que HDAC6 régule la stabilité des microtubules et le regroupement des récepteurs de l'acétylcholine (AChR) dans les fibres musculaires normales57. Nous nous sommes donc demandé si HDAC6 pouvait jouer un rôle dans le patho-mécanisme de la DMD et être utilisé comme nouvelle cible thérapeutique de la maladie. Pour tester cela, nous avons étudié l'effet de TubA, un inhibiteur hautement sélectif de HDAC6, dans le modèle de souris DMD mdx et les cellules C2C12. Dans l'ensemble, nos résultats montrent que l'inhibition pharmacologique de l'activité HDAC6 désacétylase avec TubA est bénéfique pour le muscle des souris mdx, à la fois fonctionnellement et morphologiquement. L'étude mécaniste du mode d'action de TubA a révélé que l'inhibition de HDAC6 régule à la baisse la signalisation du TGF-β par une augmentation de l'acétylation de Smad3 dans le muscle squelettique.

Pour évaluer l'effet de l'inhibition de l'activité HDAC6 désacétylase chez des souris déficientes en dystrophine, des souris mdx âgées de 7 semaines ont reçu des injections intrapéritonéales quotidiennes de TubA (mdx-TubA) ou de véhicule (mdx-veh) à une dose de 25 mg/kg /jour comme décrit précédemment46,58. Les souris ont été traitées pendant 30 jours pour permettre la comparaison avec des études précliniques antérieures utilisant cette durée de traitement chez des souris mdx59,60,61. Des souris témoins de type sauvage non traitées (WT-CTL) ont été utilisées comme témoins de base (Fig. 1a). L'efficacité du traitement avec TubA a d'abord été évaluée en mesurant l'augmentation de l'acétylation de la tubuline (Fig. 1b). Comme le montrent les Fig. 1c, 1d, le traitement par TubA pendant 30 jours consécutifs a provoqué, comme prévu, une forte augmentation de l'acétylation de l'α-tubuline dans le muscle tibial antérieur (TA) des souris mdx. Conformément aux données publiées 57, 58, la quantification du niveau relatif de tubuline acétylée a montré une augmentation d'environ 36, 5% ± 7, 8% après le traitement avec l'inhibiteur sélectif de HDAC6 (P <0, 001 par rapport aux souris mdx-veh). Pour confirmer que l'inhibition de HDAC6 n'affectait pas l'acétylation des histones, l'acétylation des histones H3 sur la lysine 9 (ac-H3K9) et les niveaux totaux d'histones H3 dans les muscles TA ont été évalués par Western blot. Conformément aux lésions musculaires en cours chez les souris mdx, l'acétylation de H3K9 a été augmentée dans les muscles TA des souris mdx par rapport aux animaux WT-CTL (+ 43, 8% ± 14, 6%; Fig. 1a, b supplémentaires). Le niveau de protéine HDAC6 a augmenté dans les muscles de la souris mdx par rapport aux muscles WT-CTL (+ 97 % ± 18, 7 %; Fig. 1c, d supplémentaires). Cependant, TubA n'a augmenté ni l'acétylation de H3K9 ni les niveaux de HDAC6 chez les souris mdx (P> 0, 05). Ensemble, ces données indiquent que l'injection intrapéritonéale de TubA inhibe efficacement et spécifiquement l'activité HDAC6 désacétylase dans le muscle.

un protocole de traitement TubA. Trois groupes de souris âgées de 7 semaines ont été évalués pendant 4 semaines soit sans traitement (groupe A, C57BL/10 souris : WT-CTL), soit traités par injection quotidienne pendant 30 jours consécutifs de DMSO (groupe B, C57BL/10ScSn -souris Dmdmdx/J ; mdx-veh) ou avec TubA à 25 mg/kg/jour (groupe C, souris C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J ; mdx-TubA). b Pour évaluer le niveau d'acétylation de la tubuline (ac-tubK40) dans les muscles TA, une analyse Western blot a été réalisée. Les quantifications des niveaux de protéines acétylées α-tubuline (c) et α-tubuline (α-tub, d) (n = 4–5 souris par groupe) ont été respectivement normalisées à l'α-tubuline et au 2,2,2-trichloroéthanol (TCE) . e La force de préhension a été mesurée sur une grille mesurant la force de préhension maximale des membres postérieurs normalisée en fonction du poids corporel (n = 5 souris par groupe). f Le gain de force relatif a été calculé par la différence entre la force de préhension mesurée le dernier jour (jour 30) et la veille du début du traitement (jour 0) et mesurée avec un test t apparié (n = 5 souris par groupe). g La force maximale spécifique a été évaluée par le meilleur score de force de préhension obtenu chez chaque animal au jour 30 (n = 5 souris par groupe). Pour évaluer les niveaux d'utrophine A (Utr. A) et de β-dystroglycane (β-DG) dans les muscles TA, une analyse Western blot (h, k) et une quantification (i, l) ont été effectuées (n = 4 souris par groupe). Le TCE a été utilisé comme témoin de charge. Des coupes transversales de muscle EDL ont été colorées avec un anticorps contre l'utrophine A (j, en gris) ou contre le β-dystroglycane (m, en gris). Barres d'échelle : 50 μm. n Myotubes C2C12 âgés de 4 jours prétraités pendant 24 h avec différents inhibiteurs de HDAC6 TubA (5 μM) et tubacine (TBC, 5 μM) ou avec du DMSO (CTL). o Western blots représentatifs montrant l'utrophine A. GAPDH a été utilisé comme contrôle de charge. p Quantification des niveaux de protéine Utrophine A normalisés avec GAPDH (n = 3 expériences indépendantes quantifiées). (c, d, e, f, g, i, l, p) Moustaches min à max ; la ligne au milieu de la boîte est tracée à la médiane. *P < 0,05 ; **P < 0,01 ; ns, non significatif, P > 0,05 ; Test U de Mann–Whitney. kDa, poids moléculaire relatif en kiloDalton.

Ensuite, nous avons évalué l'effet du traitement TubA sur la force musculaire chez des souris mdx. Les souris mdx non traitées âgées de sept semaines présentaient une force de préhension significativement plus faible pour toutes les pattes (P <0, 01) par rapport aux souris WT-CTL (Fig. 1e). Après 30 jours de traitement avec TubA, la force de préhension des souris mdx a été significativement augmentée de 1,5 fois (P < 0,05 par rapport aux souris mdx-veh ; Fig. 1e), avec un gain de force substantiel sur 30 jours (P < 0,05 ; Fig .1f). Le traitement TubA a presque complètement restauré la force musculaire des souris mdx aux niveaux WT (P = 0, 5476 par rapport aux souris WT-CTL; Fig. 1e). Fait intéressant, la force maximale a également été augmentée de 35% ± 9, 0% chez les souris mdx traitées avec TubA par rapport à l'animal mdx-veh, bien qu'elle n'ait pas atteint le niveau de signification en raison de la variabilité interindividuelle (P = 0, 062; Fig. 1 g). Pour évaluer la fatigabilité musculaire, une série de 8 tests de préhension successifs à 15 secondes d'intervalle ont été réalisés après 30 jours de traitement TubA. Les souris mdx traitées avec le véhicule ont montré une diminution progressive de leur force, indiquant une fatigue. Le traitement avec TubA a efficacement empêché cette baisse de la force de préhension, avec une augmentation de 24,5 % ± 6,4 % de la force de préhension à la traction en hauteur par rapport aux souris mdx traitées avec le véhicule (P < 0,05 ; Figure supplémentaire 1e). Dans l'ensemble, ces données indiquent que l'inhibition de l'activité HDAC6 désacétylase chez les souris mdx restaure la force musculaire et la fatigabilité aux niveaux de WT.

En raison de sa similitude fonctionnelle et structurelle avec la dystrophine, l'utrophine A peut compenser le manque de dystrophine dans la DMD24,29,62,63. Dans les fibres musculaires adultes et saines, l'utrophine A est exclusivement localisée au niveau des jonctions myotendineuses et des synapses64,65 et il est maintenant bien établi que l'expression de l'utrophine A tout au long des fibres musculaires peut compenser efficacement le manque de dystrophine24,29,66,67,68. Les souris Mdx présentent un phénotype globalement plus doux que les patients DMD69. Cela s'explique en partie par la régulation à la hausse compensatoire de l'expression de l'utrophine A dans le sarcolemme24,25,29,62,63,70,71. Les muscles de tous les groupes d'animaux décrits dans la Fig. 1a ont ainsi été analysés par Western blot et immunofluorescence pour évaluer les niveaux d'utrophine A. Comme prévu, les niveaux d'utrophine A ont été augmentés au niveau du sarcolemme (P < 0,05, Fig. 1 h) dans mdx souris par rapport aux souris WT-CTL. Le traitement TubA a encore augmenté les niveaux d'utrophine A d'environ 2 fois par rapport aux souris mdx-veh (P <0, 05; Fig. 1i). Des expériences d'immunofluorescence ont en outre établi que le traitement TubA provoquait effectivement une augmentation des niveaux d'utrophine A dans le sarcolemme dans les muscles de souris mdx, conférant ainsi un effet protecteur plus élevé sur l'intégrité des fibres musculaires (Fig. 1j). De plus, nous avons évalué à la fois la quantité et la localisation du β-dystroglycane (β-DG), un membre du DGC, afin de déterminer si le traitement TubA provoquait un réassemblage du DGC le long du sarcolemme. Comme prévu, en l'absence de dystrophine, l'accumulation de β-DG au niveau de la membrane plasmique est fortement diminuée (Fig. 1k, m). La quantification par Western blot a révélé que TubA augmentait la quantité de β-DG chez les souris mdx de 43, 2% ± 7, 0% (P <0, 05; Fig. 1 l). Des expériences d'immunofluorescence avec TubA (Fig. 1 m) ont indiqué qu'en plus de l'augmentation des niveaux d'utrophine A, l'accumulation de β-DG au niveau de la membrane plasmique était augmentée, suggérant que le traitement TubA favorisait le réassemblage du complexe DGC.

Pour déterminer si les effets de TubA sur l'expression de DGC ont également été observés dans des cellules musculaires en culture, des myotubes C2C12 ont été traités pendant 24 heures avec 5 µM de l'un des deux inhibiteurs sélectifs de l'activité HDAC6 désacétylase : TubA et tubacin72 (TBC; Fig. 1n). Après le traitement, l'expression de l'utrophine A a été évaluée sur des extraits de cellules entières par Western blot (Fig. 1o). Les deux inhibiteurs de HDAC6 ont induit une régulation à la hausse significative des niveaux d'utrophine A d'environ 1, 75 fois (P <0, 05) dans les cellules musculaires C2C12 par rapport aux cellules traitées avec le véhicule (Fig. 1p). Ensemble, ces données démontrent que les traitements avec des inhibiteurs de HDAC6 augmentent les niveaux d'utrophine A dans les myotubes C2C12, en accord avec les données obtenues in vivo avec des souris mdx.

Pour déterminer si le traitement TubA apportait des avantages supplémentaires aux fibres musculaires mdx, l'atrophie musculaire a été évaluée. Des études histopathologiques antérieures ont montré qu'une distribution anormale de la taille des fibres, avec une forte augmentation des très petites fibres, est une caractéristique des muscles dystrophiques73. La distribution de la taille des fibres a donc été évaluée en mesurant la surface de section transversale (CSA) des fibres individuelles dans le muscle soléaire oxydatif lent (SOL) et le muscle long extenseur digitorum glycolytique rapide (EDL), chez des souris mdx traitées avec TubA ou véhicule et dans contrôler les souris. Comme prévu, les profils CSA des muscles mdx traités par le véhicule présentaient une hétérogénéité substantielle et comportaient de nombreuses petites fibres par rapport aux muscles sains (Fig. 2a, b). Dans tous les muscles analysés, TubA a restauré la distribution de la taille des fibres à un niveau comparable à celui des muscles WT en diminuant de manière significative la proportion de petites fibres musculaires et en réduisant la proportion de grandes fibres musculaires (Fig. 2c, d). Chez les souris mdx traitées avec TubA, ces adaptations musculaires se sont accompagnées d'une diminution significative du coefficient de variance moyen. En effet, le traitement TubA a réduit d'environ 25% (P <0, 01, par rapport aux souris mdx-veh) le coefficient de variance des fibres CSA dans les muscles mdx EDL et SOL (Fig. 2e, f). Dans l'ensemble, 30 jours de traitement avec TubA ont normalisé la distribution de la taille des fibres dans les muscles EDL et SOL mdx, indiquant un effet protecteur de TubA contre l'atrophie et la dégénérescence musculaires.

Zones de coupe transversale (CSA) des muscles EDL (a) et SOL (b) entiers de souris C57BL/10 âgées de 11 semaines (WT-CTL) et de souris C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J traitées avec le véhicule-DMSO (mdx -veh) ou avec TubA (mdx-TubA) pendant 30 jours consécutifs ont été colorées à l'aide de la coloration à la laminine puis binarisées sur ImageJ (n = 5 souris par groupe). Barres d'échelle : 500 μm. Résumé graphique du CSA dans le muscle EDL (c) et SOL (d) (n = 5 souris par groupe ; les muscles EDL et SOL entiers ont été comptés par souris). c, d Les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes ± SEM. *P < 0,05 ; **P < 0,01 ; ANOVA à deux facteurs (mdx-TubA versus mdx-veh). Les CSA médians de chaque muscle sont affichés au-dessus des histogrammes de fréquence. Mesures du coefficient de variance dans les fibres musculaires EDL (e) et SOL (f) (n = 5 souris par groupe). Pour évaluer les niveaux de MAFbx (g, h) et MuRF1 (i, j) dans les muscles TA, une analyse Western blot (g, i) et des quantifications (h, j) ont été effectuées (n = 5 souris par groupe). k Des exemples représentatifs de coupes transversales de muscles EDL et SOL ont été colorés à l'aide d'hématoxyline et d'éosine. Barres d'échelle : 100 µm. Les fibres à nucléation centrale sont colorées en vert. Pourcentage de nucléation centrale dans les fibres musculaires EDL (l) et SOL (m) (n = 4 ou 5 souris par groupe). Pour évaluer les niveaux de collagène de type I alpha 1 (n, o, Col1A1) et de facteur de croissance du tissu conjonctif (p, q, CTGF) dans les muscles TA, une analyse Western blot (n, p) et des quantifications (o, q) ont été effectuées ( n=4 souris par groupe). Le TCE a été utilisé comme contrôle de chargement pour tous les Western blots. Pour évaluer le niveau d'infiltration du contenu de collagène, la coloration au trichrome de Masson (r) et la quantification (s) ont été réalisées dans le muscle SOL. Barres d'échelle : 500 µm. Les zones fibrotiques sont colorées en bleu (n = 28 à 50 champs comptés par souris, 3 souris par groupe). (e, f, h, j, l, m, o, q, s) Moustaches min à max ; la ligne au milieu de la boîte est tracée à la médiane. *P < 0,05 ; **P < 0,01 ; ***P < 0,001 ; ns, non significatif, P > 0,05 ; Test U de Mann–Whitney. kDa, poids moléculaire relatif en kiloDalton.

Nous avons précédemment montré que HDAC6 contribue à l'atrophie musculaire42. Compte tenu de l'augmentation globale de la taille des fibres observée dans les muscles mdx lors du traitement par TubA, nous avons étudié le mécanisme par lequel l'inhibition pharmacologique de HDAC6 diminuait l'atrophie musculaire chez les souris mdx (Fig. 2 g, i). A cet effet, l'expression de marqueurs protéiques impliqués dans l'atrophie musculaire a été évaluée par Western blot. TubA a provoqué une réduction de 57 % ± 11 % de MAFbx/atrogin1 (P < 0,05 ; Fig. 2 h) et une réduction de 35 % ± 4 % de l'ubiquitine-protéine ligase E3 MuRF1/TRIM63 (P < 0,05 ; Fig. 2j) par rapport aux animaux mdx-veh. Ensemble, ces données indiquent que l'inhibition de HDAC6 réduit l'expression des médiateurs clés de l'atrophie musculaire, fournissant ainsi une explication à la normalisation de la taille des fibres musculaires.

De plus, l'hétérogénéité de la taille des fibres mdx résulte principalement de la présence de petites fibres régénérantes suite à la perte de fibres nécrotiques. La nucléation centrale est un indicateur clé des lésions musculaires dans les fibres musculaires dystrophiques73,74. Pour évaluer l'effet de TubA sur l'étendue des lésions musculaires, le nombre de fibres à noyaux centraux a été évalué à l'aide d'une coloration à l'hématoxyline-éosine (Fig. 2k). TubA a provoqué une diminution significative du nombre de fibres centronucléées (−15% ​​± 2% dans le muscle EDL, Fig. 2 l et −24% ± 2% dans le muscle SOL, Fig. 2 m; les deux P <0, 05, par rapport à mdx -veh souris). De plus, la perte de fibres musculaires s'accompagne d'une accumulation progressive de tissu fibreux75. Nous avons donc étudié par Western blot si l'expression des protéines associées à la fibrose dans les muscles mdx était réduite par TubA (Fig. 2n, p). Les niveaux de protéines de la chaîne alpha 1 du collagène de type I (Col1A1) et du facteur de croissance du tissu conjonctif (CTGF) ont tous deux été réduits chez les souris mdx traitées avec TubA par rapport aux souris mdx traitées avec le véhicule (-36% ± 7%, Fig. 2o et -16 % ± 1 %, Fig. 2q ; respectivement, P < 0,05). Pour confirmer ces résultats, une coloration au trichrome de Masson a été réalisée sur des cryosections de muscles SOL (Fig. 2r) et EDL (Fig. 2a supplémentaire). TubA a significativement diminué la zone fibrotique dans le muscle mdx SOL (P <0, 001; Fig. 2s) par rapport au contrôle mdx SOL (véhicule traité). Dans le muscle EDL, l'effet TubA sur la surface globale positive au collagène n'a pas atteint la signification (P> 0, 05; Figure supplémentaire 2b). Néanmoins, TubA a efficacement empêché la formation de zones à forte teneur en collagène dans le muscle mdx EDL. Au total, ces données montrent que l'inhibition de HDAC6 dans le muscle dystrophique réduit la nucléation centrale, normalise la distribution de la taille des fibres, diminue la proportion de petites fibres et prévient la fibrose.

La dystrophine et l'utrophine A relient le complexe DGC au réseau de microtubules10,76. En accord avec les données précédentes10,77, nous avons confirmé par Western blot et coloration par immunofluorescence que les fibres musculaires TA et EDL de souris mdx ont plus de tubuline et une plus grande densité de microtubules, respectivement, que les souris WT-CTL (P <0, 05, Fig. 1d et Supplémentaire Fig. Fig. 3a, b). Cependant, le traitement TubA n'a pas affecté l'abondance globale de l'α-tubuline (P> 0, 05 par rapport aux souris mdx-veh; Fig. 1d). Dans le muscle sain, le réseau de microtubules forme un réseau de grille avec des microtubules longitudinaux, transversaux et périnucléaires78,79,80. Ici, chez les souris WT-CTL, nous avons observé que les microtubules transversaux et longitudinaux sont régulièrement espacés de ∼2 µm et ∼5 µm, respectivement (voir les pointes de flèches Fig. 3a et Supplémentaires Fig. 3c – e). Dans les muscles mdx, les expériences d'immunofluorescence montrent une désorganisation du réseau de microtubules, avec une perte de l'organisation en grille (voir flèches Fig. 3a). Fait intéressant, chez les souris mdx traitées avec TubA, le réseau de microtubules a été restauré (voir l'espacement entre les microtubules dans les balayages de lignes bleues et jaunes et la Fig. 3c – e supplémentaire). Nous avons ensuite analysé le réseau de microtubules avec un logiciel spécifiquement développé pour analyser la directionnalité des microtubules81 (programme TeDT ; Fig. 3b). L'analyse du programme TeDT a révélé une diminution significative des microtubules orientés transversalement (centrés autour de 90 °) dans les muscles mdx traités par le véhicule par rapport aux souris mdx WT et aux souris mdx traitées par TubA (P <0, 05 par rapport aux souris mdx-veh). Ces données montrent que le traitement TubA améliore l'organisation du réseau de microtubules dans les muscles mdx. En accord avec des travaux antérieurs57,82, cela démontre en outre que l'acétylation des microtubules via l'inhibition de HDAC6 stabilise les microtubules et favorise leur orientation transversale.

a, c Fibres isolées de TA provenant de souris C57BL/10 âgées de 11 semaines (WT-CTL) et de souris C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J traitées avec véhicule-DMSO (mdx-veh) ou avec TubA (mdx-TubA) pour 30 jours consécutifs ont été colorés avec un anticorps contre la β-tubuline (ß-tub) pour marquer le réseau MT (a, en rouge) ou colorés avec de l'α-bungarotoxine-A488 (c, en vert, α-BTX – A488) pour marquer les NMJ . Barres d'échelle : 25 μm. b Analyse de l'organisation du réseau MT à l'aide du logiciel TeDT (n = 4 à 6 fibres de 3 souris). Le graphique généré final présente un score global pour chaque degré d'orientation MT donné, avec 0 et 180 degrés correspondant au MT longitudinal et 90 degrés correspondant au MT transversal ; histogrammes directionnels (HD). Les pointes de flèches représentent une organisation régulière du réseau MT tandis que les flèches montrent une désorganisation du réseau MT, avec une perte de l'organisation en grille. Un résumé graphique du diamètre de la plaque d'extrémité du NMJ (d) et de la compacité du NMJ (e) a été réalisé. d, e, *, ** et *** comparaison entre les souris mdx-veh et mdx-TubA. La médiane de chaque groupe de souris est affichée au-dessus des histogrammes de fréquence (n = 40 à 75 NMJ comptés). La distribution du nombre de fragments (f) et l'indice de fragmentation (g) ont été quantifiés (n = 43-73 des NMJ comptés). g Moustaches min à max ; la ligne au milieu de la boîte est tracée à la médiane. *P < 0,05 ; **P < 0,01 ; ***P < 0,001 ; (mdx-TubA contre mdx-veh), test Mann–Whitney U.

La distribution très fragmentée du récepteur post-synaptique de l'acétylcholine (AChR) observée dans les muscles mdx suggère fortement que la dystrophine participe au maintien du NMJ83. Étant donné que l'inhibition de HDAC6 augmente la compacité de la distribution de l'AChR au niveau du NMJ57, nous avons analysé l'organisation du NMJ chez des souris mdx témoins et traitées (Fig. 3c). La coloration à l'α-bungarotoxine, utilisée pour visualiser le récepteur de l'acétylcholine, a indiqué que l'organisation du NMJ était gravement compromise chez les souris témoins traitées avec mdx-veh par rapport aux NMJ témoins WT (Fig. 3c, d), comme prévu par les travaux précédents84,85,86. Plus spécifiquement et par rapport aux muscles WT, la compacité des NMJ mdx-veh a été diminuée de 26 % ± 11 % (P < 0,05 ; Fig. 3e), la surface globale des NMJ a été augmentée de 38 % ± 18 % (P < 0,05 ; Fig. 3d), l'indice de fragmentation a été multiplié par environ deux (P < 0,001 ; Fig. 3g) et le nombre moyen de fragments par NMJ a été augmenté (P < 0,001 ; Fig. 3f). Le traitement TubA a restauré presque à la normale la surface du NMJ (−24 % ± 13 %, P < 0,05 par rapport aux NMJ mdx traités par le véhicule ; Fig. 3d) et la compacité (+ 31,3 % ± 12,5 %, P < 0,05 par rapport aux NMJ mdx traités par le véhicule ; Fig. 3e et Supplémentaire Fig. 3f, g). Comparé aux souris mdx traitées avec le véhicule, TubA a également partiellement normalisé l'indice de fragmentation -13,2% ± 2% (P <0,05; Fig. 3g) et le nombre de fragments par NMJ (+63% ± 1% de NMJ composés de 1 à 3 fragments, P < 0,05 ; figure 3f). Au total, le traitement TubA a partiellement restauré la distribution normale de l'AChR dans les fibres musculaires de la souris mdx via une augmentation de la compacité et du recrutement des patchs AChR.

La transcription de la dystrophine est connue pour être également contrôlée via la voie mTOR87. En effet, le déficit en mTOR entraîne une diminution du contenu musculaire en dystrophine et provoque des anomalies dystrophiques conduisant à une myopathie sévère. Dans ce contexte, nous avons étudié si l'inhibition de HDAC6 dans le muscle mdx pouvait favoriser la synthèse des protéines en mesurant la phosphorylation de divers composants de la voie mTOR (Fig. 4a). Le niveau de protéine mTOR n'a pas été significativement modifié avec le traitement TubA (P = 0, 342; Fig. 4b, c) alors qu'une augmentation d'environ 2 fois de la phosphorylation de la kinase p70-S6 à la thréonine 389 a été observée ( P <0, 05; Fig. 4d, e) . Conformément à l'activité accrue de la kinase p70-S6, nous avons observé une augmentation d'environ 2 fois de la phosphorylation de S6 sur Ser235-236 et Ser240-244 (P <0, 05; Fig. 4f, g, h). Enfin, TubA a induit une augmentation significative de la phosphorylation de l'inhibiteur de traduction 4E-BP1 sur les sites sensibles à mTOR comme le montre l'augmentation du rapport de 4E-BP1 γ sur 4E-BP1 β isoformes pour phospho-Thr37-46, phospho -Thr70 ainsi que pour le total 4E-BP1 (Fig. 4i, j, k, l). Au total, nos données montrent qu'un traitement de 30 jours avec TubA stimule la synthèse des protéines musculaires chez les souris mdx via la voie mTOR.

un résumé schématique des cibles en aval de mTOR. Des souris C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J âgées de 11 semaines traitées avec TubA (mdx-TubA) ou avec véhicule-DMSO (mdx-veh) pendant 30 jours consécutifs ont été analysées dans le muscle TA par analyse Western blot (b, d, Fi). Quantifications de mTOR (c), pp70 S6 kinase (e, T389), pS6 (g, S240/244), pS6 (h, S235/236), p4E-BP1 (j, T37/46), p4E-BP1 (k , T70) et 4E-BP1 (l) ont été réalisées (n = 4 souris par groupe). Le TCE a été utilisé comme témoin de charge. (c, e, g, h, j, k, l) Moustaches min à max ; la ligne au milieu de la boîte est tracée à la médiane. *P < 0,05 ; ns, non significatif, P > 0,05 ; Test U de Mann–Whitney. kDa, poids moléculaire relatif en kiloDalton.

Pour déterminer si l'effet de TubA sur la voie mTOR a également été observé dans des cellules musculaires en culture, des myotubes C2C12 ont été prétraités pendant 24 heures avec TubA puis traités avec de la rapamycine, un inhibiteur sélectif du complexe mTOR 1 (mTORC1) (Fig. 4a). Après le traitement, la phosphorylation de la protéine S6 a été évaluée sur des extraits de cellules entières par Western blot (Fig. 4b supplémentaire). Comme prévu, sur la base des données in vivo, le traitement avec TubA a augmenté la phosphorylation de S6 dans les cellules musculaires C2C12, par rapport aux cellules traitées avec le véhicule (Fig. 4c, d supplémentaires). En présence de rapamycine, la phosphorylation de S6 a été considérablement réduite, en présence ou en l'absence de TubA (P <0, 001; Fig. 4c, d supplémentaires). Par conséquent, l'inhibition de HDAC6 agit en amont du complexe mTOR pour activer la voie. Dans ces expériences, nous avons également évalué si l'augmentation de l'expression de l'utrophine A par le traitement TubA reposait sur la voie mTOR. L'expression de l'utrophine A a été évaluée en présence de TubA avec ou sans rapamycine. La rapamycine a empêché la régulation positive de l'utrophine A par TubA, indiquant que l'augmentation de l'utrophine A induite par TubA implique la voie mTOR (Figure 4f supplémentaire). La signalisation mTOR et TGF-β sont des acteurs clés de la régulation de la masse musculaire et ces voies sont interconnectées37,88.

Les effets de TubA sur la voie mTOR, l'atrophie musculaire et la fibrose nous ont incités à explorer si l'inhibition de HDAC6 affectait la signalisation du TGF-β. L'atrophie musculaire induite par la myostatine, membre du TGF-β, implique la signalisation Smad2/3 qui active l'expression de MAFbx et régule à la baisse la signalisation mTOR89,90. Les protéines Smad2/3 nécessitent une phosphorylation pour pénétrer à l'intérieur du noyau et activer ses gènes cibles91. Fait intéressant, il a également été démontré que les protéines Smad2/3 sont acétylées dans le noyau92,93. Des myoblastes C2C12 de souris ont été traités pendant 24 heures avec le véhicule (DMSO), TubA ou SB431542 (SB43), un inhibiteur spécifique de la voie TGF-β/Activin/NODAL94. Après élimination des inhibiteurs, les myoblastes C2C12 ont été exposés pendant 30 min au TGF-β195 humain recombinant (rhTGF-β1) et la localisation subcellulaire de Smad2/3 a été analysée par immunofluorescence à l'aide d'anticorps anti-tubuline acétylée et anti-Smad2/3.

Le traitement TubA a également augmenté l'acétylation de la tubuline en présence et en l'absence de rhTGF-β1, indiquant que la signalisation du TGF-β n'affecte pas l'activité de la HDAC6 désacétylase (Fig. 5a et Supplémentaires Fig. 3a, c). Comme prévu96,97, le traitement au rhTGF-β1 a augmenté la phosphorylation de Smad2/3 au niveau des sérines 465-467 et 423-425, respectivement (Fig. 3b supplémentaire). De manière constante, des expériences d'immunofluorescence et de Western blot dans des cellules C2C12, respectivement, ont indiqué que le rhTGF-β1 augmentait la phosphorylation et l'accumulation nucléaire de Smad2 / 3 qui étaient bloquées par SB43 (Fig. 5a, b et Supplémentaire Fig. 5a – d). En présence de TubA, la phosphorylation et l'accumulation nucléaire de Smad2/3 étaient fortement diminuées (Figs. 5a – d, f – h et Supplémentaire Fig. 5a – d), et ces réductions étaient corrélées à une augmentation de l'acétylation de Smad3 (P < 0,05, figure 5e). Pour confirmer ces résultats, le fractionnement cellulaire a été effectué en présence ou en l'absence de TubA pour séparer une fraction cytosolique (CE) et une fraction nucléaire, cette dernière étant ensuite subdivisée en un extrait nucléaire (NE) et un extrait de chromatine (Chrm) . En présence de TubA, le rapport cytoplasmique du phosphoSmad3 nucléaire au phosphoSmad3 cytoplasmique était inversé, confirmant que l'inhibition de HDAC6 réduisait la translocation nucléaire de Smad3 (Fig. 5f, g).

a – e Myoblastes C2C12 âgés de 4 jours prétraités pendant 24 h avec soit un inhibiteur HDAC6 (TubA, 5 μM), soit un inhibiteur sélectif du TGF-β1 (SB43, 5 μM) ou avec du DMSO (CTL). Les myoblastes ont ensuite été traités pendant 30 min avec du TGF-β1 humain recombinant (rhTGF-β1; 10 ng/mL). a Les myoblastes ont été doublement colorés avec des anticorps contre Smad2/3 (en vert) et de la tubuline acétylée (ac-tub, en rouge). Les noyaux ont été marqués au DAPI (en bleu). Barres d'échelle : 50 µm. b Résumé graphique de la distribution nucléaire de l'intensité de fluorescence Smad2/3 à partir de 3 expériences indépendantes ; ANOVA bidirectionnelle (TubA + rhTGF-β1 versus DMSO + rhTGF-β1). c Les niveaux de phosphorylation de Smad2/3 (pSmad), d'acétylation de Smad2/3 (ac-Smad), de Smad2/3, d'α-tubuline acétylée (ac-tub) et d'α-tubuline (α-tub) ont été visualisés par analyse Western blot . Pour évaluer les niveaux de phosphorylations Smad2/3 (d) et d'acétylation Smad3 (e) dans les cellules C2C12, des quantifications ont été effectuées (n = 5 expériences indépendantes quantifiées) ; Test U de Mann–Whitney. f, g Le fractionnement cellulaire en 3 fractions a été effectué : fraction cytosolique (CE), extrait nucléaire (NE) et extrait de chromatine (Chrm). f Les niveaux de phosphorylation de Smad3 (S423-425), Smad2/3, α-tubuline acétylée (ac-tub-K40), GAPDH, HIRA et histone H3 (H3) ont été visualisés par Western blot à partir de 3 expériences indépendantes. g Quantifications de la distribution de la phosphorylation de Smad3 (S423-425) ; ANOVA à deux facteurs. Des immunoprécipitations de chromatine (ChIP) ont été réalisées en utilisant des anticorps contre Smad2/3. Des amplifications qPCR de régions promotrices immunoprécipitées du gène MAFbx (h) ou MuRF1 (i) ont été utilisées pour détecter la présence de ces fragments d'ADN dans des immunoprécipités (h, i, n = 3 expériences indépendantes) ; Test U de Mann–Whitney. *, P < 0,05. (j, k, l, m, n) Des souris C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J âgées de 11 semaines et traitées avec le véhicule-DMSO (mdx-veh) ou avec TubA (mdx-TubA) pendant 30 jours consécutifs ont été analysées dans Muscle TA par analyse Western blot (j) et quantifié (k, l, m, n). Pour évaluer les niveaux d'acétylation de Smad3 (k), d'acétylation de Smad2 (l), de phosphorylation de Smad3 (m) et de Smad2/3 (n) dans les muscles TA, des quantifications ont été effectuées (n = 4 souris par groupe) ; Test U de Mann–Whitney. Le TCE a été utilisé comme contrôle de chargement pour tous les Western blots. (d, e, k, l, m, n) Moustaches min à max ; la ligne au milieu de la boîte est tracée à la médiane. (b, g, h, i) Les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes ± SEM. *P < 0,05 ; **P < 0,01 ; ***P < 0,001 ; ns, non significatif, P > 0,05. kDa, poids moléculaire relatif en kiloDalton.

Pour étudier l'impact fonctionnel de cette redistribution cellulaire et déterminer si TubA affecte l'activation des gènes cibles Smad2/3, un test Smad2/3 ChIP a été effectué sur des cellules C2C12 traitées avec rhTGF-β1 ou rhTGF-β1 plus TubA. Les sites de liaison Smad putatifs ont été identifiés par analyse logicielle en amont du site de début de transcription dans les promoteurs de MAFbx et MuRF1, c'est-à-dire entre les positions -618 et -424 et les positions -319 et -205 pour MAFbx, et entre les positions -727 et -608 pour MURF1. Les régions promotrices -1978 à -1805 et -1320 à -1232 ont été utilisées comme témoins négatifs pour MAFbx et MURF1, respectivement. La présence de TubA a significativement réduit la liaison de Smad2/3 aux promoteurs de MAFbx (−63 % ± 12 % et −34 % ± 4 %) et MURF1 (−38 % ± 7 %) au niveau de leurs régions de liaison prédites (P < 0,05 ; Fig. 5h, i), qui complète bien les données de fractionnement cellulaire.

La signalisation TGF-β est connue pour être régulée positivement dans les muscles dystrophiques98. Pour confirmer in vivo que l'inhibition de HDAC6 réduisait la signalisation du TGF-β, l'acétylation et la phosphorylation de Smad2/3 ont été évaluées par Western blot dans les muscles TA de souris mdx traitées avec le véhicule-DMSO ou TubA (Fig. 5j). Chez les souris mdx traitées avec TubA, l'acétylation de Smad3 sur Lys19 était presque trois fois plus élevée que chez les souris mdx traitées au DMSO (P <0, 05; Fig. 5k), tandis que l'acétylation de Smad2 n'était pas affectée (P> 0, 05; Fig. 5l). Cette augmentation de l'acétylation de Smad3 s'est accompagnée d'une diminution de 55% ± 4% de la phosphorylation de Smad3 sur Ser432-425 (P <0, 05; Fig. 5m). Chez les souris mdx, le traitement TubA avait tendance à augmenter le niveau total de Smad2/3 par rapport à l'animal mdx-veh. Cependant, cette augmentation n'était pas statistiquement significative (P = 0,0571 ; Fig. 5n). L'effet de TubA sur les niveaux de Smad4 et Smad7 a également été évalué et aucune différence n'a été observée avec les témoins (Fig. 5e – h supplémentaire).

Les mécanismes reliant les voies mTOR et TGF-β/Smad sont encore mal connus. Néanmoins, il a été démontré précédemment que Smad3 activait la traduction des ARNm de PTEN, inhibant ainsi la signalisation Akt/mTOR et la synthèse des protéines39 (Fig. 5i supplémentaire). Nous avons donc étudié une éventuelle régulation à la baisse de l'expression de PTEN consécutive à l'inhibition de Smad 3 par TubA. À la fois dans les muscles de la souris mdx et dans les cellules C2C12, TubA a induit une diminution des niveaux de protéine PTEN (P <0, 05; Fig. 5j – m supplémentaire). Les niveaux de protéines Akt et la phosphorylation ont également été examinés et, conformément à la diminution des niveaux de PTEN, les niveaux de protéines Akt1 et Akt2 et la phosphorylation ont augmenté en présence de TubA (P <0, 05; Fig. 5n – s supplémentaire). Au total, cela indique que TubA active très probablement la voie mTOR via Smad3 et PTEN.

Ici, nous avons évalué l'effet de l'inhibition de HDAC6 par TubA chez des souris mdx et dans des cellules musculaires C2C12. Le traitement TubA a significativement amélioré la fonction musculaire mdx et diminué les caractéristiques dystrophiques histopathologiques globales. A la recherche du mécanisme d'action de HDAC6, nous avons découvert que HDAC6 régulait la signalisation du TGF-β via l'acétylation de Smad3, identifiant ainsi Smad3 comme une nouvelle cible de HDAC6. TubA a augmenté l'acétylation de Smad3, empêchant la phosphorylation et la translocation nucléaire de Smad2/3, diminuant ainsi l'expression d'atrogènes tels que MAFbx et MuRF1 et régulant à la hausse la voie mTOR. Dans l'ensemble, ce mécanisme peut expliquer l'effet bénéfique de l'inhibition de HDAC6 pour contrer l'atrophie musculaire et la fibrose dans les muscles mdx (Fig. 6).

L'inhibiteur HDAC6 tel que TubA induit une diminution de l'activité HDAC6 qui conduit à une acétylation de l'α-tubuline et de Smad3. L'inhibition pharmacologique de HDAC6 permet une augmentation de l'acétylation de l'α-tubuline pour restaurer le DGC et stabiliser l'organisation du réseau MT/NMJ. De plus, l'inhibition spécifique de HDAC6 augmente l'acétylation de Smad3 qui peut interférer avec la signalisation TGF-β à la fois pour réduire l'atrophie musculaire en réduisant l'expression d'acteurs clés tels que MAFbx/MuRF1 et pour stimuler la synthèse des protéines via la voie mTOR. Nos résultats identifient HDAC6 comme une cible pharmacologique d'intérêt pour la DMD.

HDAC6 est largement exprimé dans tous les tissus du corps38. Dans le cancer, HDAC6 est surexprimé et connu pour être corrélé à un mauvais pronostic99,100. Ici, nous avons observé que l'expression de HDAC6 est augmentée chez les souris mdx, ce qui indique qu'elle pourrait participer à la pathologie DMD. En accord avec cette notion, l'inhibition sélective de HDAC6 avec TubA a diminué de multiples caractéristiques pathologiques du muscle de souris mdx, sans affecter les niveaux d'expression de HDAC6. Ceci suggère que l'effet bénéfique de l'inhibition de HDAC6 réside dans la réduction de son activité désacétylase, indépendamment de son taux protéique.

Nos résultats indiquent que la stabilisation des microtubules en empêchant leur désacétylation préserve l'organisation des microtubules dans les muscles déficients en dystrophine. Dans les muscles mdx, la perte de production de force est généralement attribuée à des déficiences structurelles du cytosquelette des fibres musculaires et à des modifications de la signalisation101. Fait intéressant, il a été démontré que la stabilisation du réseau de microtubules protège contre les lésions induites par la contraction, ce qui suggère que le ciblage du cytosquelette des microtubules peut offrir de nouvelles opportunités d'intervention thérapeutique dans la DMD77. En conséquence, les muscles mdx traités avec TubA contiennent moins de fibres centronucléées, peut-être parce que les fibres musculaires sont plus résistantes.

Nos données montrent que TubA restaure partiellement la morphologie NMJ chez les souris mdx. Chez les patients DMD et les souris mdx, les NMJ sont sensiblement désorganisés et présentent des déficits de la fonction / transmission neuromusculaire, soulignant ainsi la contribution de l'altération de la NMJ dans la fonction altérée et la récupération des muscles dystrophiques83, 102, 103, 104. Nous avons récemment montré que HDAC6 est impliqué dans l'organisation des microtubules au niveau du NMJ, en régulant la distribution de l'AChR et l'organisation du NMJ57. Chez les souris mdx, des modifications structurelles des microtubules au niveau du NMJ sont probablement impliquées dans la désorganisation du NMJ85. Notre présente étude indique que la protection de la structure NMJ en stabilisant les microtubules participe probablement à l'effet bénéfique du traitement TubA sur la fonction musculaire mdx. Dans les muscles mdx, les NMJ sont anormalement grands en raison de la fragmentation et nos résultats actuels indiquent que la stabilisation du réseau de microtubules limite cette fragmentation, ce qui est cohérent avec nos résultats précédents qui ont montré que l'augmentation de l'acétylation des microtubules limite la propagation du NMJ58. L'augmentation des niveaux d'utrophine A pourrait également participer à l'amélioration de l'organisation du NMJ par TubA.

Une augmentation significative des taux d'utrophine A est corrélée à un meilleur pronostic chez les patients atteints de DMD105. Par conséquent, la capacité de l'inhibition de HDAC6 à augmenter les niveaux d'utrophine A extra-synaptique participe probablement à la préservation de l'intégrité du muscle mdx. La manière dont HDAC6 régule l'utrophine A reste à déterminer, nous avons observé ici que la rapamycine empêche l'augmentation de l'expression de l'utrophine A par TubA, indiquant l'implication de la voie mTOR. Une action bénéfique supplémentaire de TubA pourrait également être médiée par la restauration du réseau de microtubules qui, à son tour, pourrait améliorer le trafic d'utrophine A vers la membrane.

Contrairement à la plupart des HDAC qui agissent directement sur l'expression des gènes via des complexes régulateurs de transcription, HDAC6 est strictement cytoplasmique et aucun de ses substrats connus n'est un facteur de transcription. Ici, nous montrons que HDAC6 désacétyle Smad3 et régule son accumulation nucléaire. Les protéines Smad2/3 médient l'action de la signalisation TGF-β pour favoriser le catabolisme et la fibrose des protéines et pour inhiber l'anabolisme des protéines. L'inhibition de l'accumulation nucléaire de Smad2/3 par l'inhibition de HDAC6 peut donc expliquer l'effet bénéfique de TubA sur la fibrose rénale106, la réduction de l'atrophie musculaire et la stimulation de la synthèse protéique via la voie mTOR. Les effets bénéfiques des inhibiteurs d'HDAC tels que Givinostat, ont déjà été démontrés chez des souris mdx et des patients DMD pour stimuler l'expression de la follistatine, une protéine de liaison à l'activine, dont l'activité principale est de bloquer la signalisation du TGF-β27,56,107. Ces effets bénéfiques de HDAC6 sur les muscles mdx récapitulent les effets du Givinostat. De plus, dans les muscles des patients mdx et DMD, l'inhibition de l'activité du TGF-β atténue à la fois la dégénérescence et la fibro-calcification108 et la fibrose27. De manière constante, l'inhibition de HDAC6 a également réduit la fibrose dans les muscles mdx.

Dans une tentative de lier l'effet de TubA sur la signalisation du TGF-β à mTOR, nous avons observé que l'expression de PTEN était diminuée par TubA, soulignant le rôle connu de Smad3 dans l'activation de la traduction de PTEN37. Les niveaux de PTEN sont connus pour être élevés dans les muscles dystrophiques des patients DMD et des souris mdx, et il a été démontré que l'inhibition de PTEN améliore la régénération musculaire et la fonction chez les souris mdx109. Par conséquent, l'effet de TubA sur l'expression de PTEN participe probablement à l'amélioration des muscles mdx.

Fait intéressant, plutôt que d'affecter directement l'expression de gènes individuels comme indiqué pour d'autres HDAC, HDAC6 agit sur la signalisation TGF-β en ciblant Smad3 dans le cytoplasme. Par conséquent, HDAC6 régule les cibles en aval de Smad2/3, fournissant ainsi une nouvelle entrée pharmacologique pour interférer avec la signalisation TGF-β. Smad2 et Smad3 partagent 92 % d'identité de séquence, mais leurs fonctions ne sont pas complètement redondantes. Les souris knock-out Smad2 meurent au jour embryonnaire 10,5 avec des anomalies vasculaires et crâniennes et une altération de la structuration gauche-droite110,111 alors que les souris knock-out Smad3 sont viables mais souffrent d'une fonction immunitaire altérée et d'une inflammation chronique112,113. De plus, ils présentent des préférences pour l'association avec des facteurs de transcription spécifiques. Par exemple, Smad3 interagit préférentiellement avec FoxO sur Smad232. Fait intéressant, des rapports antérieurs sur l'acétylation de Smad2/3 impliquaient exclusivement des facteurs nucléaires92,93 et ​​l'effet de l'acétylation de Smad2/3 était corrélé à la liaison du promoteur, à l'activité de transactivation, à l'exportation nucléaire ou à la stabilité des protéines. Dans le noyau, Smad3 est acétylé à la lysine 19 par p300/CBP en réponse au TGF-β, ce qui augmente son activité de liaison à l'ADN et sa liaison aux promoteurs des gènes cibles114. L'acétylation de Smad3 peut réguler sélectivement à la hausse ou à la baisse l'expression des gènes régulés par le TGF-β. Il convient de noter que Smad3 peut également être acétylé sur plusieurs autres lysines92,93. HDAC6 étant strictement cytoplasmique, la désacétylation de Smad3 par HDAC6 affecte probablement différents processus. Nos résultats indiquent que l'augmentation de l'acétylation de Smad3 réduit la phosphorylation de Smad 3 et son accumulation nucléaire. Nous pouvons donc supposer qu'empêcher la désacétylation de Smad3 dans le cytoplasme réduit sa phosphorylation par les récepteurs TGF-β et/ou réduit son association avec Smad4. Au total, l'acétylation de Smad3 dans le noyau est nécessaire pour activer l'expression de ses gènes cibles, tandis que l'acétylation de Smad3 dans le cytoplasme inhibe sa fonction. Curieusement, malgré le niveau élevé de similitude entre Smad2 et Smad3, l'inhibition de HDAC6 a augmenté de manière sélective l'acétylation de Smad3, mais elle a affecté la phosphorylation et l'entrée nucléaire de Smad2 et de Smad3. Nous émettons l'hypothèse que Smad3 acétylé dans le cytoplasme pourrait se lier à Smad2 et inhiber sa phosphorylation, et que la formation d'un dimère Smad2/3 acétylé pourrait réduire leur capacité à pénétrer dans le noyau. Il est concevable qu'après son activation par p300, les molécules Smad2/3 acétylées qui sont réexportées du noyau vers le cytoplasme nécessitent une désacétylation par HDAC6 pour permettre leur réentrée dans la voie du TGF-β. Par conséquent, l'inhibition de HDAC6 empêcherait la désacétylation de Smad3 dans le cytoplasme, réduisant ainsi la quantité de Smad2/3 disponible pour participer à la signalisation du TGF-β et augmentant la quantité de Smad2/3 cytoplasmique. Une autre possibilité serait que la désacétylation de Smad3 par HDAC6 régule son ubiquitination et sa dégradation ultérieure. Les deux hypothèses sont cohérentes avec le fait que l'inhibition de HDAC6 augmente la quantité de protéine Smad2/3 cytoplasmique.

Des connexions fonctionnelles entre HDAC6 et TGF-β ont déjà été rapportées. En effet, il a été démontré que la phosphorylation et l'accumulation nucléaire de Smad3 étaient régulées par HDAC6106,115. Il a également été démontré que le TGF-β induisait la désacétylation de l'α-tubuline par HDAC6, entraînant une motilité cellulaire accrue115, et la stabilité des microtubules régule la phosphorylation de Smad induite par le TGF-β116,117,118. En montrant ici que HDAC6 régule à la fois Smad3 et l'acétylation des microtubules, nos résultats fournissent un lien moléculaire direct entre la stabilité des microtubules et la signalisation TGF-β.

Dans un précédent travail, nous avons montré que l'expression de HDAC6 était augmentée lors de l'atrophie musculaire et qu'elle participait à la fonte musculaire via une interaction directe avec l'ubiquitine ligase MAFbx42. Par conséquent, nous proposons que l'inhibition de HDAC6 empêche la dégradation des protéines musculaires à deux niveaux : l'inhibition de la signalisation TGF-β via Smad2/3 et l'inhibition de l'ubiquitination et la dégradation ultérieure des substrats MAFbx. L'inhibition de la signalisation TGF-β s'est également avérée bénéfique pour limiter la cachexie et la progression du cancer dans des modèles murins119,120. De nombreuses tumeurs sécrètent du TGF-β et la découverte que HDAC6 régule le TGF-β pourrait également être pertinente pour expliquer les effets bénéfiques observés sur la progression du cancer avec les inhibiteurs de HDAC653,54,121.

En résumé, nos résultats montrent que l'inhibition pharmacologique de HDAC6 améliore de manière significative plusieurs marqueurs fonctionnels, biochimiques et morphologiques dans les muscles squelettiques de souris déficientes en dystrophine via trois mécanismes complémentaires (Fig. 6) : (i) la stabilisation des microtubules qui favorise la restauration des NMJ et DGC, (ii) augmentation des niveaux d'utrophine A, (iii) inhibition de la signalisation TGF-β via le ciblage Smad3 qui réduit l'atrophie musculaire, la fibrose et stimule la synthèse des protéines. En conséquence, l'inhibition de HDAC6 avec des agents pharmacologiques représente une cible thérapeutique intéressante pour la DMD offrant de nombreux avantages, notamment la facilité d'administration, l'impact sur tous les muscles et les bénéfices pour tous les patients, quelles que soient les mutations de la dystrophine.

Toutes les procédures utilisant des animaux ont été approuvées par le comité d'éthique de l'établissement et ont suivi les directives du Conseil national de recherches Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire, et par le Comité de protection des animaux de l'Université d'Ottawa. Toutes les procédures étaient conformes aux lignes directrices du Conseil canadien de protection des animaux. Pour les expériences in vivo, le contrôle mâle C57 black 10 (C57BL10) et le mâle C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J mdx ont été utilisés (The Jackson Laboratory Bar Harbor, USA). Tous les animaux ont été maintenus dans des conditions spécifiques exemptes d'agents pathogènes. Ces souris ont été logées dans un cycle de 12 h de lumière/12 h d'obscurité à une température contrôlée (23 °C ± 0,9 °C) avec une humidité de 50 % ± 4 %, une installation avec libre accès à la nourriture et à l'eau. Des souris Mdx ont été traitées pendant 30 jours consécutifs avec soit de la tubastatine A (TubA, APExBIO, #A4101 ; 25 mg/kg/jour, par voie intrapéritonéale) solubilisée dans du DMSO à 2 %, soit une solution saline additionnée de DMSO à 2 % (véhicule-témoin)46. Ces souris ont été entretenues au Service vétérinaire et animalier de l'Université d'Ottawa. Tous les travaux sur les animaux ont été conformes à toutes les réglementations éthiques pertinentes. Après traitement, les souris ont été anesthésiées avec une anesthésie à l'isoflurane (référence VI-1586 sur appareil TEM SEGA, MiniTag V1 / Evaporator Tec7) et ont été euthanasiées par dislocation cervicale. Ensuite, les muscles ont été disséqués et soit : (i) congelés et broyés dans de l'azote liquide pour l'extraction des protéines et de l'ARN ou (ii) intégrés dans un composé Tissue-Tek OCT (VWR, Mississauga, Canada) et congelés dans de l'isopentane refroidi avec de l'azote liquide pour cryostat les coupes57 ou (iii) ont été dissociées manuellement80 avec les modifications suivantes : des fibres TA simples ont été fixées 30 min à température ambiante dans du PBS-4 % de paraformaldéhyde, perméabilisées 60 min dans du PBS-1 % de Triton X-100 à 30 °C avant saturation et incubation avec des anticorps comme décrit ci-dessous.

Toutes les injections et tous les tests comportementaux ont été effectués en aveugle à la plate-forme de recherche sur le comportement animal de l'Université d'Ottawa. Pour les expériences TubA, les injections quotidiennes ont été poursuivies pendant la période de test comportemental. Pour minimiser les interférences, les injections ont été effectuées l'après-midi après la fin de chaque test. Avant chaque test, les souris ont été habituées à la pièce pendant au moins 30 min et les tests ont été effectués dans des conditions d'éclairage normales. Les souris ont été manipulées une fois par jour pendant 3 jours avant le premier test. La force musculaire de chaque animal a été mesurée à l'aide d'un appareil de mesure de la force de préhension (Chatillion DFE II, Columbus Instruments) avec toutes les pattes (test de force de préhension des membres postérieurs). La souris a été rapprochée du compteur jusqu'à ce qu'elle ait une prise ferme sur la sonde. La souris a été tirée horizontalement loin de la barre à une vitesse d'environ 2,5 cm/s, jusqu'à ce qu'elle libère la sonde. La valeur de la force maximale maximale a été enregistrée (gF). Ceci a été répété huit fois avec des intervalles de 15 secondes pour chaque animal. Chez chaque animal à 30 jours, le meilleur score a été défini comme la force maximale spécifique. Les mesures de force de préhension ont été réalisées par le même investigateur afin de limiter la variabilité et ont été réalisées dans un ordre aléatoire. L'investigateur effectuant les mesures a été aveuglé quant au groupe de traitement de chaque souris individuelle lors du test.

Des cellules C2C12 (ATCC, CRL-1772) ont été ensemencées sur des plaques recouvertes de matrigel (matrice matrigel®, Corning) de 35 mm de diamètre et ont été maintenues sous forme de myoblastes dans du milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) additionné de 10 % de sérum bovin fœtal et de 1 % pénicilline-streptomycine (Multicell). Puis les cellules ont été différenciées dans du milieu de différenciation (milieu DMEM additionné de 2% de sérum de cheval, Bio Media Canada). Les cellules cultivées dans des plaques de 35 mm de diamètre ont été traitées pour Western blot ou immunofluorescence. Pour le transfert Western, les cellules ont été collectées par trypsinisation, lavées avec du PBS, centrifugées et stockées à -20 ° C jusqu'à leur utilisation. Pour l'immunofluorescence, les cellules ont été fixées pendant 20 min dans du PBS-paraformaldéhyde à 4 % à température ambiante, lavées dans du PBS et stockées à 4 °C jusqu'à leur utilisation.

Les cellules C2C12 ont été traitées avec différents médicaments : TubA (à 5 µM, APExBIO, #A4101), tubacine (TBC, 5 µM, Sigma, #SML0065), rapamycine (rapa,100 nM, Sigma #CAS 53123-88-9) et SB 431542 (SB43, 10 uM, Tocris, #1614). Le TGF-β1 humain recombinant (rhTGF-β1, 10 ng/mL, #100-21) a été acheté chez PeproTech. Tous les anticorps primaires utilisés dans cette étude sont présentés dans le tableau supplémentaire 1. Les anticorps secondaires utilisés pour les études d'immunofluorescence ont été couplés à Alexa-Fluor 488 ou Alexa-Fluor 555 (Molecular Probes) ; ou à Cy3 ou Cy5 (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Les anticorps secondaires utilisés pour le Western blot étaient soit des anticorps polyclonaux anti-IgG de lapin couplés à la peroxydase de raifort (HRP) (Bio-Rad), soit des anticorps anti-IgG de souris HRP de chèvre (Bio-Rad). Tous les anticorps utilisés dans cette étude ont été validés par les fabricants ou dans des travaux de laboratoire précédemment publiés. Pour visualiser le NMJ pour les études d'immunofluorescence, nous avons utilisé des conjugués α-Bungarotoxine à 5 µg/mL avec Alexa-Fluor 488 (Molecular Probes, # B13422) et DAPI (Sigma-Aldrich ; # D9542) a été utilisé pour colorer l'ADN nucléaire. Pour visualiser et quantifier les protéines sur Western blot, nous avons utilisé du 2,2,2-Trichloroéthanol122 (TCE, Sigma, #T54801).

Les muscles TA ont été prélevés sur les membres postérieurs de souris adultes et les muscles disséqués ont été écrasés sur de la neige carbonique. Poudre musculaire remise en suspension dans un tampon urée/thiourée [urée 7 M, thiourée 2 M, chaps 65 mM, DTT 100 mM, DNase I 10 U, inhibiteurs de protéase (Complete ; Roche/Sigma-Aldrich)] et la concentration en protéines a été déterminée à l'aide de CB- Kit de dosage des protéines X (G-Bioscience, St. Louis, MO). Après trypsination, les cellules C2C12 ont été solubilisées dans un tampon RIPA [Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, 1 % NP-40, 0,5 % désoxycholate de sodium, 0,1 % SDS et inhibiteurs de protéase (Complete ; Roche/Sigma-Aldrich) ]. La concentration en protéines a été déterminée à l'aide du kit d'analyse de protéines BCA (Pierce/ThermoFisher Scientific) conformément aux recommandations du fabricant.

Cinq à vingt µg de protéines totales ont été séparés par SDS-PAGE additionné de 0,5 % de TCE et transférés sur des membranes de nitrocellulose ou de PVDF. La liaison non spécifique a été bloquée avec de l'albumine de sérum bovin à 4 % (BSA, Euromedex) diluée dans du PBS IX additionné de Tween à 0,1 %, et les membranes ont été incubées avec des anticorps primaires. Après un lavage soigneux avec 0,1 % de Tween 1X PBS, les membranes ont été incubées avec des anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort (HRP) (Jackson Immunoresearch Laboratories/Cederlane). Après des lavages supplémentaires, les signaux ont été révélés à l'aide de réactifs de substrat ECL (Bio-Rad) et les acquisitions ont été effectuées à l'aide d'un ChemiDocTM MP Imaging Systems (Bio-Rad) ou autoradiographiées avec des films X-Ray (Fisher Scientific). Les quantifications basées sur la membrane TCE ont été réalisées avec le logiciel Image Lab (Bio-Rad) ou le logiciel FIJI (ImageJ 2.0.0-rc-69/1.52n, National Institutes of Health, Bethesda, MD).

Des échantillons de muscle EDL et SOL congelés ont été placés à -20 ° C dans le cryostat (HM 525 NX, Thermo Fisher Scientific) pendant au moins 20 min avant un traitement ultérieur. Des coupes musculaires de 10 µm d'épaisseur ont été coupées transversalement. Les coupes musculaires ont été colorées avec des colorants hématoxyline et éosine. Les coupes ont été déshydratées en utilisant des solutions d'éthanol à 70 %, 90 % et 100 % et lavées avec du toluène. Les coupes ont été montées à l'aide de Permount (Thermo Fisher Scientific) et visualisées à l'aide d'un microscope inversé épifluorescent EVOS FLAuto2 au centre de biologie cellulaire et d'acquisition d'images de l'Université d'Ottawa (RRID : SCR_021845). Le pourcentage de nucléation centrale a été déterminé en comptant le nombre total de fibres musculaires et le nombre de fibres musculaires à nucléation centrale de 6 à 8 vues en coupe à l'aide du logiciel Northern Eclipse (NES, EMPIX Imaging). Des colorations au trichrome de Masson ont été réalisées sur des coupes transversales de soléaire et de cryostat EDL à la plate-forme d'histologie Louise Pelletier de l'Université d'Ottawa (RRID:SCR_021737). Les coupes ont été fixées dans une solution de Bouin (75 ml d'acide picrique saturé, 25 ml de formaldéhyde à 37–40 %, 5 ml d'acide acétique glacial) pendant 1 h à 56 °C et rincées à l'eau courante jusqu'à ce que la couleur jaune disparaisse. Ensuite, les coupes ont été colorées dans de l'hématoxyline de Weigert (parties égales de la solution A : 1 g d'hématoxyline, 100 ml d'alcool à 95 % ; et solution B : 4 ml de chlorure ferrique à 29 %, 95 ml d'eau distillée, 1 ml d'acide acétique glacial) pendant 10 min et lavé à l'eau courante pendant 10 min. Les coupes ont été colorées dans une solution de fuchsine acide écarlate de Biebrich (90 ml d'écarlate de Biebrich aqueux à 1%, 10 ml de fuchsine acide aqueuse à 1%, 1 ml d'acide acétique glacial) pendant 2 minutes et rincées à l'eau. Les lames ont été incubées dans une solution d'acide phosphomolybdique-phosphotungstique (2,5 g d'acide phosphomolybdique, 2,5 g d'acide phosphotungstique, 120 ml d'eau distillée) pendant 10 à 15 min, colorées avec une solution de bleu d'aniline (2,5 g de bleu d'aniline, 2 ml d'acide acétique glacial, 100 ml eau distillée distillée) pendant 5 min, rincés, placés dans une solution d'acide acétique à 1 % pendant 3 à 5 min, déshydratés avec de l'alcool éthylique à 95 % et absolu, clarifiés avec du xylène et montés avec des lamelles. Les sections ont été imagées avec un Zeiss Axio Scan. Z1 équipé d'un objectif Plan-Apochromat 20x/0.8. Les noyaux sont colorés en noir, le cytoplasme en rouge et le collagène en bleu.

Des incubations avec des anticorps primaires dans du PBS-0,1 % de Tween 20 ont été réalisées soit à température ambiante pendant 60 min (cellules C2C12) soit à 4 °C pendant une nuit (fibres musculaires dissociées isolées) et lavées. Après incubation pendant 1 à 3 heures à température ambiante avec des anticorps secondaires fluorescents, l'ADN nucléaire a été coloré au DAPI pendant 10 min. Les lamelles ont été montées sur des lames de microscope avec le réactif FluorSaveTM (Calbiochem). Les images ont été capturées à température ambiante sur un microscope Zeiss LSM880 (Carl Zeiss) avec un détecteur AiryScan1 équipé d'un objectif 63 × 1,4-NA à INMG ou un microscope droit Zeiss Axio Imager M2 (Carl Zeiss) équipé soit d'un 63 × 1,4-NA. Objectifs NA ou 10 × 0,45 NA et détecteur AxioCam mRm CCD à la plateforme de biologie cellulaire et d'acquisition d'images de l'Université d'Ottawa (RRID : SCR_021845). Toutes les images ont été traitées avec le logiciel ZEN blue, le logiciel Zeiss AxioVision (Zeiss, Oberkochen, Allemagne), Photoshop CS5 (Abobe Systems, San Jose, CA, USA) ou le logiciel FIJI (ImageJ 2.0.0-rc-69/1.52n , Instituts nationaux de la santé, Bethesda, MD). Les images ont été analysées en aveugle en renommant au hasard les noms de fichiers avec des nombres à l'aide de la macro 'name_randomizer' dans ImageJ80.

Les cellules C2C12 ont été prétraitées avec TubA pendant 24 h puis traitées pendant 30 min avec TGF-ß1. Les cellules ont ensuite été recueillies et culottées à 300 g à 4 ° C pendant 3 min. Les culots ont été remis en suspension avec 10 volumes de tampon E1 glacé (NaOH 20 mM pH 7,6, acétate de potassium 5 mM, MgCl2 0,5 mM) complétés par 1 x cocktail inhibiteur de protéase et 1 x cocktail inhibiteur de phosphatase et placés dans un homogénéisateur Dounce de 1 mL. Les cellules ont été homogénéisées avec 25 coups de pilon lâche et incubées 10 min sur de la glace avant centrifugation à 2100 × g à 4 ° C pendant 3 min. Le surnageant a été collecté (extrait de cytoplasme, CE) et le culot a été remis en suspension dans le même volume de tampon E1 additionné de 600 mM de NaCl. La suspension a été incubée 30 min sur de la glace et centrifugée à 20 000 × g pendant 20 min. Le surnageant a été recueilli (extrait nucléaire, NE) et le culot a été remis en suspension dans le même volume de tampon E1 additionné de 600 mM de NaCl et de Benzonase (1/1000, Millipore, 71205) et correspondant à l'extrait de chromatine (Chrm). Le même volume de chaque fraction a été chargé sur des gels Any kD Mini PROTEAN TGX (Biorad), transféré sur une membrane de nitrocellulose et révélé avec l'anticorps indiqué.

Des immunoprécipitations de la chromatine (ChIP) de la protéine Smad2/3 située sur les séquences promotrices des atrogènes (MAFbx et MuRF1) ont été réalisées à l'aide du kit SimpleChIP® Plus Sonication Chromatin IP (Cell Signaling Technology) comme suit : les cellules C2C12 ont été prétraitées ou non traitées avec TubA pendant 24 h puis avec TGF-ß1 pendant 30 min. Les cellules ont été lavées dans 5 ml de milieu de culture cellulaire (DMEM Glutamax) en l'absence de sérum de veau fœtal. Les cellules ont ensuite été incubées dans du DMEM Glutamax additionné de paraformaldéhyde à 1 % pendant 10 min à 25 °C. La réticulation a été arrêtée en ajoutant de la glycine à une concentration finale de 0,125 M et une incubation à 25 °C pendant 15 minutes. Les cellules ont été collectées dans du PBS 1X en grattant les plaques, lavées dans du PBS 1X et remises en suspension dans un tampon de lyse cellulaire de sonication ChIP (SimpleChIP® Plus Sonication Chromatin IP Kit) contenant un cocktail d'inhibiteurs de protéase 1X à une concentration de 2,107 cellules/mL. Après 15 minutes sur de la glace, les cellules ont été recueillies par centrifugation 3 minutes à 3000 g, 4 ° C et remises en suspension dans un tampon de lyse cellulaire de sonication ChIP contenant un cocktail d'inhibiteurs de protéase 1X. Après 5 minutes sur glace, cette dernière étape a été répétée une troisième fois pendant 10 minutes. Les cellules ont été soniquées dans un Covaris S220 dans un tube de 1 ml (puissance de crête : 140 ; facteur de service 10 ; cycles/rafale : 200) pendant 12 min à 4 °C. L'efficacité de la sonication a été contrôlée sur un gel d'agarose à 1% pour vérifier la présence de fragments dans la gamme 500-1000 pb et la concentration de chromatine a été évaluée sur une fraction déréticulée à l'aide d'une nanogoutte. L'immunoprécipitation a été réalisée comme indiqué dans le protocole du kit ChIP CST en incubant 2,5 µg de chromatine avec 10 µL d'anticorps dans un volume final de 500 µl (ajusté avec un tampon de lyse par sonication ChIP) pendant 12 h à 4 ° C avec rotation. Les anticorps ChIP utilisés sont : IgG (CST ; #2729 ; comme contrôle négatif) ; Histone H3 (CST; #4620, comme témoin positif); Smad 2/3 (CST; #8685). Les fragments immunoprécipités ont été récupérés, purifiés et déréticulés selon le protocole du kit CST. La présence d'ADN a été détectée par QPCR (Biorad CFX Connect) en utilisant SsoADV Universal SYBR Green Supermix (Biorad) et les amorces suivantes (Eurogentec) : région promotrice MAFbx -205/-319 (Fbxo32-5F : 5'TTCCTTGCTACACCCTGCTT3' ; Fbxo32- 5R : 5'ACCTCTGCACCTCCCCTACT3'); Région promotrice MAFbx -424/-618 (Fbxo32-2F : 5'CTTCTTTCCCCTTCCTTTGC3' ; Fbxo32-2R : 5'GGTAGGGGTGCATTCTTTGA3'); Région promotrice non apparentée MAFbx -1232/-1320 (Fbxo32-7F : 5'GGCCTGCCAGTACAGAGACAAT3' ; Fbxo32-7R : 5'AGGTGTCTTCCTTGCTCACG3'); Région promotrice de MuRF1 -608/-727 : (Trim63-2F : 5'CAGCAAAGGGTGTTCATGT3' ; Trim63-2R : 5'CTCAGTGGTAAAGGGGCTTG3') ; Région promotrice non apparentée à MuRF1 -1805/-1978 : (Trim63-9F : 5' GTGGATCCAGGAACTGAAT' ; Trim63-9R : 5' GGCTGTCCTGGAACTCACTC3').

À l'aide d'ImageJ, l'organisation des microtubules a été visualisée avec des balayages de lignes verticales (barres jaunes) et horizontales (barres bleues). À l'aide d'un outil d'analyse de la directionnalité récemment développé81 (TeDT), la directionnalité du réseau de réseau de microtubules a été calculée pour toutes les lignées de souris. Une ANOVA à deux voies a été utilisée pour évaluer l'effet de l'angle d'intersection des microtubules entre les groupes. Des mesures post-hoc de test U bilatéral (Mann-Whitney) ont été utilisées pour déterminer l'étendue des différences entre les groupes. La signification a été fixée à P < 0,05.

Pour une analyse précise, chaque image a été capturée par un seul NMJ en face. Les NMJ qui étaient partiellement obliques par rapport au champ de vision n'étaient inclus que si la partie oblique constituait moins d'environ 10 % de la surface totale. Pour quantifier la compacité et l'indice de fragmentation, les images ont été analysées grâce à la méthodologie 'NMJ-morph'123. La compacité des AChR au niveau de la plaque d'extrémité a été définie comme suit : Compacité \(=\,\left(\frac{{{{{{\rm{AChR}}}}}}\ ; {{{{{\rm{area }}}}}}}{{{{{\rm{endplate}}}}}} ; {{{{{\rm{zone}}}}}}}\right)\,\times 100\ ).

L'indice de fragmentation a été calculé selon lequel une plaque d'extrémité solide en forme de plaque a un indice de (0) et une plaque d'extrémité très fragmentée a un indice qui tend vers une valeur numérique de (1) : Indice de fragmentation \(=\,1-\left(\ frac{1}{{{{{\rm{nombre}}}}}}\ ; {{{{{\rm{of}}}}}}\ ; {{{{{\rm{AChR}} }}}}\ ; {{{{{\rm{cluster}}}}}}}\right)\).

Les dimensions de base de la plaque motrice post-synaptique ont été mesurées à l'aide des fonctions ImageJ standard. 'NMJ-morph' est utilisé pour quantifier le nombre de grappes discrètes d'AChR comprenant la plaque motrice.

Toutes les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide de Prism 6.0 (GraphPad Software, La Jolla, États-Unis). Le test U bilatéral non paramétrique (Mann–Whitney) a été appliqué. Pour une analyse factorielle multiple de la variance, une ANOVA à deux facteurs a été appliquée. Les valeurs de p inférieures à 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives (représentées par un seul astérisque dans les chiffres).

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les données sources sont fournies avec ce document. Il n'y a aucune restriction sur la disponibilité des données dans ce manuscrit. Les données brutes principalement générées dans cette étude sont fournies dans les informations supplémentaires en tant que fichier de données source. Des chiffres supplémentaires sont fournis à la fin du fichier d'informations supplémentaires. Les données sources sont fournies avec ce document.

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Nous remercions John Lunde, Jean Luc Thomas, Amanda Tran, Laurent Coudert, Nawres Ben Marzouk et Jacques Brocard pour leur aide technique experte et leurs discussions fructueuses. Nous remercions les installations de microscopie PLATIM et CIQLE de Lyon et le Centre de biologie cellulaire et d'acquisition d'images de l'Université d'Ottawa (RRID : SCR_021845) pour l'accès aux microscopes. Le financement de ce travail a été obtenu via une bourse de l'Association Française contre les Myopathies (téléthon AFM) à BJJAO qui a bénéficié d'une bourse postdoctorale de l'AFM au cours de ce travail. Un soutien supplémentaire pour ce travail est venu du téléthon de l'AFM à travers l'alliance stratégique MyoNeurALP, de la Fondation pour la Recherche Médicale à travers un financement « équipe FRM » à LS et des Instituts de recherche en santé du Canada à BJJ

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Bernard J. Jasmin, Laurent Schaeffer.

Physiopathologie et Génétique du Neurone et du Muscle (INMG-PGNM), CNRS UMR 5261, INSERM U 1315, Université de Lyon, Lyon, France

Alexis Osseni, Edwige Belotti, Isabella Scionti, Yann-Gaël Gangloff, Vincent Moncollin, Laetitia Mazelin, Rémi Mounier, Pascal Leblanc & Laurent Schaeffer

Centre de Biotechnologie Cellulaire, Hospices Civils de Lyon, Lyon, France

Alexis Osséni & Laurent Schaeffer

Département de médecine cellulaire et moléculaire, Faculté de médecine, 451, chemin Smyth, Université d'Ottawa, Ottawa, ON, K1H 8M5, Canada

Aymeric Ravel-Chapuis & Bernard J. Jasmin

Centre des maladies neuromusculaires Éric Poulin, Faculté de médecine, Université d'Ottawa, Ottawa, ON, K1H 8M5, Canada

Bernard J. Jasmin

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AO, BJJ et LS ont conçu l'étude, conçu le projet et obtenu une subvention. AO et ARC ont effectué l'immunofluorescence et toutes les expérimentations animales. AO et EB ont réalisé des expériences de fractionnement cellulaire. AO et IS ont réalisé des expériences sur le TGF-β. AO, LM et YGG ont réalisé des expériences mTOR. AO et PL ont effectué tous les Western blots. AO et VM ont effectué des expériences ChIP. AO a réalisé toutes les expériences de culture cellulaire. AO a créé les Fig. 1a et 6 sur Adobe Illustrator. AO et LS ont rédigé le premier projet de manuscrit. AO, ARC, EB, IS, YGG, VM, LM, RM, PL, BJJ et LS ont analysé, interprété les données, révisé, finalisé le manuscrit et fourni des commentaires et des modifications.

Correspondance à Alexis Osseni, Bernard J. Jasmin ou Laurent Schaeffer.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie Chiara Mozzetta et les autres évaluateurs anonymes pour leur contribution à l'évaluation par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Osseni, A., Ravel-Chapuis, A., Belotti, E. et al. L'inhibition pharmacologique de HDAC6 améliore les phénotypes musculaires chez les souris déficientes en dystrophine en régulant à la baisse le TGF-β via l'acétylation de Smad3. Nat Commun 13, 7108 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-34831-3

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Reçu : 28 janvier 2022

Accepté : 01 novembre 2022

Publié: 19 novembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-022-34831-3

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Communication Nature (2022)

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