Identification et caractérisation biochimique d'un nouveau N

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 16991 (2022) Citer cet article

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La N-acétylglucosamine (GlcNAc) est un composant clé des glycanes tels que la glycoprotéine et la paroi cellulaire. La GlcNAc kinase est une enzyme qui transfère un phosphate sur la GlcNAc pour générer le GlcNAc-6-phosphate, qui peut être un précurseur de la synthèse des glycanes. Les kinases GlcNAc ont été trouvées dans un large éventail d'organismes, y compris les levures pathogènes, les humains et les bactéries. Cependant, cette enzyme n'a jamais été découverte chez Saccharomyces cerevisiae, un modèle eucaryote. Dans cette étude, la première kinase GlcNAc de S. cerevisiae a été identifiée et nommée Ngk1. Les valeurs Km de Ngk1 pour GlcNAc et le glucose étaient de 0,11 mM et 71 mM, respectivement, ce qui suggère que Ngk1 possède une forte affinité pour GlcNAc, contrairement aux hexokinases. Ngk1 a montré l'activité de phosphorylation de GlcNAc avec divers nucléosides triphosphates, à savoir ATP, CTP, GTP, ITP et UTP, en tant que donneurs de phosphoryle. Ngk1 est phylogénétiquement éloigné des enzymes connues, car l'identité de la séquence d'acides aminés avec les autres n'est que d'environ 20% ou moins. Le rôle physiologique de Ngk1 dans S. cerevisiae est également discuté.

La N-acétylglucosamine (GlcNAc), un glucide omniprésent chez les procaryotes et les eucaryotes, est un composant essentiel des glycanes tels que les N-glycoprotéines, les ancres GPI et les parois cellulaires, y compris les peptidoglycanes des bactéries et les chitines des levures1,2,3. Pour la biosynthèse des glycanes, l'uridine diphosphate N-acétylglucosamine (UDP-GlcNAc) est un substrat essentiel chez les procaryotes et les eucaryotes car la fraction GlcNAc de ce sucre nucléotidique est incorporée dans les glycanes par les glycosyltransférases2,3. Généralement, l'UDP-GlcNAc est synthétisée à partir de fructose-6-phosphate (Fru-6-P), un intermédiaire de glycolyse, qui peut être converti en glucosamine-6-P3. Chez les eucaryotes, la glucosamine-6-P est acétylée en GlcNAc-6-P, suivie de l'isomérisation en GlcNAc-1-P3. Chez les procaryotes, en revanche, la glucosamine-6-P est principalement isomérisée en glucosamine-1-P, puis acétylée en GlcNAc-1-P3,4. Dans l'étape finale, GlcNAc-1-P est converti en UDP-GlcNAc par uridylation chez les procaryotes et les eucaryotes3,4.

La kinase GlcNAc (EC 2.7.1.59) est une enzyme métabolisant la GlcNAc découverte dans de nombreuses espèces d'organismes, y compris les bactéries, les levures pathogènes, les plantes et les animaux3,4,5,6,7,8. Cette enzyme transfère le groupe gamma-phosphoryle d'un ATP sur le groupe hydroxyle au C-6 de GlcNAc pour générer un GlcNAc-6-P. La kinase GlcNAc est structurellement liée à l'hexokinase (EC 2.7.1.1), qui est un autre type de sucre kinase qui agit préférentiellement sur le glucose (Glc) pour générer du Glc-6-P à la première étape de la glycolyse, car ces enzymes ont généralement un domaine ATPase9,10. Chez les mammifères, la GlcNAc kinase est connue comme une enzyme qui fournit une voie de récupération de la biosynthèse de l'UDP-GlcNAc puisque cette enzyme produit du GlcNAc-6-P, qui peut être un précurseur de l'UDP-GlcNAc11. En revanche, le rôle de NagK, la GlcNAc kinase d'Escherichia coli, dans l'utilisation de GlcNAc pour la biosynthèse de Fru-6-P a été étudié car il existe une voie inversée pour convertir GlcNAc-6-P en Fru-6-P pour la source d'énergie dans la glycolyse4. De même, CaNag5, la kinase GlcNAc de la levure pathogène Candida albicans, a également été identifiée et signalée comme étant impliquée dans l'utilisation de GlcNAc pour générer Fru-6-P comme source d'énergie3,5,6. Comme les bactéries, C. albicans peut se développer sur GlcNAc comme source de carbone. En effet, il existe une voie pour convertir la GlcNAc en Fru-6-P chez C. albicans, car le groupe de gènes des enzymes métabolisant la GlcNAc, composé de la GlcNAc kinase (CaNAG5) ainsi que de la GlcNAc-6-P désacétylase (CaNAG2) et de la glucosamine-6-P désaminase (CaNAG1), a été identifié à partir de la similarité de séquence avec ces enzymes d'E. coli4. Il a été démontré que la perturbation de ces gènes retardait la croissance de C. albicans sur GlcNAc comme source de carbone.

Contrairement à C. albicans, la levure bourgeonnante Saccharomyces cerevisiae ne pousse pas sur GlcNAc comme source de carbone3,5,6. De plus, tout gène similaire à CaNAG5, CaNAG2 ou CaNAG1 n'est pas conservé dans l'ensemble du génome de S. cerevisiae6. Par conséquent, il a été considéré que S. cerevisiae ne possède pas ces enzymes métabolisant la GlcNAc. Chez S. cerevisiae, la présence de trois hexokinases, Hxk1, Hxk2 et Glk1, est connue depuis les années 198012. On a cru pendant plusieurs décennies que S. cerevisiae ne possédait pas d'autre hexokinase autre que Hxk1, Hxk2 et Glk1. Cependant, nous avons remarqué et mis l'accent sur la présence de deux autres gènes de type hexokinase (mais dont les fonctions étaient inconnues) : EMI2 et YLR446W. Dans nos travaux précédents, la protéine Emi2 a été identifiée comme une quatrième nouvelle hexokinase de S. cerevisiae en plus des précédentes connues : Hxk1, Hxk2 et Glk113. Dans cette étude, nous nous sommes concentrés sur un autre gène de type hexokinase, YLR446W (nom systématique), qui n'a pas de nom de gène standard, pour examiner s'il s'agit d'une nouvelle hexokinase supplémentaire dans cet organisme modèle. De manière inattendue, nous avons découvert que YLR446W code pour une nouvelle kinase GlcNAc qui présente une faible similitude de séquence avec les kinases GlcNAc connues d'autres organismes.

Le gène YLR446W est un gène de fonction inconnue qui code pour une protéine de 433 acides aminés et possède un domaine ATPase de type hexokinase. Une recherche d'homologie n'a trouvé aucune enzyme de fonction connue présentant une similarité élevée avec la protéine codée par le gène YLR446W (YLR446Wp). Cependant, YLR446Wp a une identité de séquence d'environ 20% avec Hxk1, Hxk2, Glk1 et Emi2 de S. cerevisiae (Fig. S1 supplémentaire). De plus, ce produit génique a été prédit comme étant d'environ 50 kDa d'une protéine cytosolique qui n'a pas de séquence de peptide signal, comme c'est le cas avec Hxk1, Hxk2, Glk1 et Emi29,13. Par conséquent, nous avons commencé à examiner si ce gène code pour une hexokinase. Le YLR446Wp recombinant a été exprimé dans des cellules d'E. coli et purifié pour être utilisé dans un essai enzymatique (données non présentées).

Typiquement, l'ATP peut être un donneur de phosphoryle pour l'hexokinase en formant un complexe avec des cations divalents, tels que Mg2+. Il a été constaté que YLR446Wp présentait une faible activité de phosphorylation du glucose (0, 010 U / mg) en présence d'ATP et de Mg2 + (Fig. 1a). Les niveaux d'activité relatifs de la phosphorylation du glucose en présence d'ATP et de Mg2+, Co2+ ou Mn2+ étaient respectivement de 100 %, 170 % et 80 % (Fig. 1b), ce qui suggère que Mg2+ peut être remplacé par Co2+ ou Mn2+. En revanche, l'activité enzymatique n'a guère été détectée en présence de Ca2+ ou Zn2+. En l'absence de cations divalents, l'activité enzymatique n'a pas été observée en présence d'ATP (Fig. 1a et b). Ces résultats ont montré que YLR446Wp est une kinase qui agit sur Glc, avec un besoin en cations divalents, similaire au cas des hexokinases connues13. Il a également été constaté que l'activité glucokinase de cette enzyme en présence de 10 mM de Glc était inférieure à celle des quatre autres hexokinases, dont les valeurs étaient de 0, 044 à 180 mU pour Hxk1, Hxk2, Glk1 et Emi2 dans nos conditions de dosage. Bien que l'activité la plus élevée de YLR446Wp ait été observée en présence de Co2+, seule une trace de Co2+ intracellulaire a été détectée14. D'autre part, Mg2+ est abondant dans les cellules de levure et est connu comme un cofacteur majeur pour les kinases dépendantes de l'ATP15. Par conséquent, nous avons décidé de réaliser le dosage enzymatique en présence de Mg2+ dans les expériences ultérieures.

Dosage de l'activité de phosphorylation Glc de YLR446Wp. ( a ) L'activité enzymatique de YLR446Wp pour la phosphorylation du glucose a été surveillée à l'aide d'un dosage couplé à la glucose-6-phosphate déshydrogénase. La réaction de phosphorylation du glucose avec Ngk1 a été évaluée en présence (+) ou en l'absence (-) de MgCl2. (b) L'activité spécifique de phosphorylation du glucose en présence de MgCl2, CoCl2, MnCl2, ZnCl2, CaCl2 ou EDTA a été comparée. Le pourcentage de l'activité spécifique en présence de MgCl2 a été fixé à 100 %. Barres d'erreur, l'écart type de deux expériences indépendantes.

La plupart des hexokinases connues, y compris Hxk1, Hxk2 et Emi2, peuvent agir non seulement sur le glucose mais aussi sur le mannose, le fructose et la glucosamine13,16. Nous avons examiné si YLR446Wp peut phosphoryler des monosaccharides autres que le glucose en surveillant le produit de réaction par CCM. Le produit de phosphorylation était à peine détecté lorsque le fructose, le mannose ou le galactose était utilisé comme substrat de sucre, ce qui suggère que cette enzyme ne reconnaît pas ces monosaccharides comme substrat. En revanche, cette enzyme démontre l'activité de phosphorylation sur GlcNAc, puisque le produit de phosphorylation a été généré avec une diminution du substrat de sucre après une réaction de 30 minutes (Fig. 2a). La phosphorylation d'autres sucres aminés, glucosamine, N'N'-diacétylchitobiose, UDP-GlcNAc, N-acétylmannosamine et N-acétylgalactosamine, a également été examinée pour constater que cette enzyme ne présente pas d'activité détectable sur ces sucres aminés autres que GlcNAc (Fig. 2b). En revanche, aucune des autres hexokinases de levure, Hxk1, Hxk2, Glk1 et Emi2, n'a montré l'activité détectable sur GlcNAc (Fig. S2 supplémentaire). D'autre part, toutes ces hexokinases présentaient clairement l'activité pour Glc.

Analyses TLC de la spécificité du substrat de sucre de YLR446Wp. La spécificité de substrat de l'enzyme pour les monosaccharides (a) et les sucres aminés (b) a été contrôlée par CCM. Une réaction contenant de l'ATP, du MgCl2 et chacun des sucres suivants : GlcNAc, Glc, fructose (Fru), mannose (Man), galactose (Gal), glucosamine (GlcN), N'N'-diacétylchitobiose (GlcNAc2), UDP-GlcNAc, N-acétylmannosamine (ManNAc) ou N-acétylgalactosamine (GalNAc) a été réalisée pendant 3 0 min avec (+) ou sans (-) enzyme. Glc-6-P ou GlcNAc-6-P (15 nmol chacun) a été appliqué sur la plaque TLC comme composé standard. S, substrats de sucre ; P, produits.

Pour confirmer que YLR446Wp possède une activité GlcNAc kinase, le produit de réaction a été analysé par HPLC. Après 3 h de réaction avec l'enzyme, le pic de GlcNAc (S : RT = 4,19 min) a été diminué et largement remplacé par le produit (P : RT = 10,39 min) (Fig. 3a et b). Le temps de rétention du produit de réaction (P) correspondait essentiellement à celui de GlcNAc-6-P. Il est à noter que GlcNAc-1-P, un autre phosphate de GlcNAc, a été élué à 9,87 min dans les mêmes conditions (données non présentées). De plus, la spectrométrie ESI-MS a montré que la masse moléculaire du produit de réaction (P : RT = 10,39 min) correspondait à la masse calculée de GlcNAc-6-P [m/z [M - H] - 300]. Ces résultats suggèrent que YLR446Wp possède une activité GlcNAc kinase pour générer GlcNAc-6-P, contrairement aux autres hexokinases connues chez S. cerevisiae.

Analyse HPLC des produits de phosphorylation GlcNAc. Le mélange réactionnel en l'absence (a) ou en présence (b) de l'enzyme, comprenant 10 mM de GlcNAc, 10 mM d'ATP et 10 mM de MgCl2, a été réalisé dans du Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) à 30 ° C pendant 3 h et analysé par HPLC. Le temps de rétention de chaque pic détecté à UV = 205 nm a été adapté à celui des composés standards : S, GlcNAc (4,2 min) ; P, GlcNAc-6-P (10,4 min); ADP (12,4 minutes) ; *, Tris (4,7 min).

Les paramètres cinétiques pour GlcNAc et Glc ont été comparés en surveillant la génération d'ADP par la phosphorylation du sucre dépendante de l'ATP, grâce à l'utilisation du test couplé à la pyruvate kinase et à la lactate déshydrogénase. Avant le test, nous avons confirmé que l'activité enzymatique maximale était obtenue autour de pH 8,0 en utilisant un tampon Tris – HCl. Les valeurs de Km pour GlcNAc et Glc ont été déterminées à 0, 11 mM et 71 mM, respectivement, indiquant que l'affinité de cette kinase pour GlcNAc est environ 500 fois supérieure à celle de Glc (Fig. 4a et b). Cependant, les taux de renouvellement de ces sucres n'étaient pas significativement différents : les valeurs de kcat pour GlcNAc et Glc étaient respectivement de 2,3 s-1 et 1,1 s-1. Les valeurs Km et kcat de Ngk1 pour l'ATP, avec l'utilisation de GlcNAc comme substrat de sucre, ont été déterminées à 1, 2 mM et 3, 4 s-1, respectivement (données non présentées). Les valeurs Km des quatre autres hexokinases de S. cerevisiae pour la phosphorylation du glucose étaient inférieures à 0,20 mM (0,011–0,20 mM), alors que les valeurs kcat de ces enzymes traversaient une large plage (0,042–63 s−1)13,16. D'après ces résultats, nous avons conclu que YLR446W ne code pas pour une hexokinase typique mais code pour une nouvelle sucre kinase spécifique de GlcNAc et qui n'a jamais été identifiée chez S. cerevisiae. En conséquence, nous avons nommé ce gène NGK1, pour N-acetylglucosamine kinase 1.

YLR446W code une kinase GlcNAc nommée Ngk1. L'analyse cinétique de l'activité kinase Ngk1 de GlcNAc (a) et Glc (b) a été réalisée à l'aide d'un test couplé à la pyruvate kinase et à la lactate déshydrogénase.

Il existe peu de connaissances sur la réactivité des kinases GlcNAc sur les nucléosides triphosphates autres que l'ATP. Il a été rapporté que les cellules de levure contiennent des triphosphates de nucléoside non-ATP, CTP, GTP, ITP et UTP17. Nous avons donc examiné l'activité Ngk1 avec chacun de ces nucléosides triphosphates en tant que donneur de phosphoryle. Le produit de phosphorylation a été observé en utilisant n'importe quel triphosphate de nucléoside, y compris l'ATP, le GTP, le CTP, l'ITP et l'UTP, après la réaction avec Ngk1 (Fig. 5a). Les activités relatives contre le GTP, le CTP, l'ITP et l'UTP étaient de 15 %, 10 %, 41 % et 25 %, respectivement, par rapport à l'ATP (Fig. 5b). Le temps de rétention de chaque produit en HPLC était cohérent avec celui du GlcNAc-6-P (données non présentées). Ces données suggèrent que Ngk1 peut utiliser de larges espèces de nucléosides triphosphates pour générer GlcNAc-6-P.

Analyse de la réactivité de Ngk1 à différents nucléosides triphosphates. L'activité Ngk1 de la phosphorylation de GlcNAc en utilisant soit l'ATP, le GTP, le CTP, l'ITP ou l'UTP comme donneur de phosphoryle a été déterminée. ( a ) Analyse CCM de la réaction (40 min) avec (+) ou sans (-) enzyme. S, substrats de sucre ; P, produits. (b) Les activités spécifiques ont été déterminées en mesurant la concentration de GlcNAc-6-P par HPLC après la réaction (20 min) avec différents nucléosides triphosphates. L'activité spécifique de Ngk1 contre l'ATP a été fixée à 100 %. Barres d'erreur, l'écart type de deux expériences indépendantes.

Il était difficile d'aligner la séquence Ngk1 avec les kinases GlcNAc de structure primaire connue (par exemple, les kinases GlcNAc humaines et bactériennes) en raison de leur faible identité de séquence (moins de 15 %). Puisqu'il est supposé que la GlcNAc kinase serait fonctionnellement et structurellement similaire aux hexokinases, nous avons recherché des résidus d'acides aminés potentiels impliqués dans la réaction par alignement avec les hexokinases connues de S. cerevisiae (Fig. S1 supplémentaire). Parmi elles, les relations structure-fonction de Hxk2 ont été bien étudiées18. L'alignement multiple a indiqué que Asp-196 et Lys-152 de Ngk1 pourraient être respectivement les résidus catalytiques putatifs et de liaison à l'ATP. Le remplacement de Asp-196 ou de Lys-152 par Ala (D196A ou K152A) a considérablement diminué l'activité enzymatique (Fig. S3 supplémentaire). D196E représentait encore une partie de l'activité enzymatique, tandis que D196A et D196N n'ont pas montré d'activité détectable après une nuit de réaction. Ces résultats suggèrent que les résidus cruciaux pour la catalyse enzymatique peuvent être conservés dans Ngk1, alors que l'identité globale de Ngk1 avec d'autres hexokinases de S. cerevisiae n'est que d'environ 20 %.

L'analyse phylogénique montre que Ngk1 est éloigné des autres kinases GlcNAc connues ainsi que des hexokinases (Fig. 6). Parmi les enzymes connues, la GlcNAc kinase de C. albicans (Ca.NAG5) était la plus proche de Ngk1, bien que l'identité de séquence d'acides aminés entre elles ne soit que de 22 %. D'autres kinases GlcNAc connues provenant à la fois d'eucaryotes supérieurs (Hs.NAGK et At.GNK, de l'homme et d'Arabidopsis thaliana, respectivement) et de bactéries4 (Ec.NagK de E. coli) étaient évidemment éloignées de S. cerevisiae Ngk1 puisque leurs identités de séquence avec Ngk1 étaient inférieures à 15 %. On note que des gènes similaires à Ngk1 sont conservés sous forme de protéines hypothétiques chez des levures de la famille des Saccharomycetaceae, telles que Zygosaccharomyces rouxii (Zr. Protéine hypothétique, identique à 41 % à Ngk1), bien qu'aucun d'entre eux n'ait été caractérisé.

Analyse phylogénétique de Ngk1 avec GlcNAc kinases et hexokinases. Arbre phylogénétique des kinases et hexokinases GlcNAc identifiées ou putatives. Les arbres phylogénétiques suivants ont été générés avec Clustal Omega19 et visualisés avec le Dendroscope 320. Ngk1 et hexokinases de S. cerevisiae : Sc.Unch(Ngk1)(AAT92658.1), Sc.Hxk1(NP_116711.3), Sc.Hxk2(NP_011261. 1). ), Sc.Glk1 (NP_009890.1), Sc.Emi2 (NP_010804.3). GlcNAc kinases de C. albicans (Ca.NAG5, BAB43816.1), humain (Hs.NAGK, EAW99780.1), E. coli (Ec.NagK, NP_415637), Salmonella enterica (Se.NagK, EDN6582917.1), Arabidopsis thaliana (At.GNK, NP_564358.1), Eutrema salsugineum (Es.NAGK, XP_006415457.1) et Gorilla gorilla gorilla (Gg.NAGK, XP_018876635.1). N-acétylmannosamine kinases de Staphylococcus aureus (Sa.ROK, WP_000291445.1) et Staphylococcus pseudintermedius (Sp.ROK, WP_214533982.1). Hexokinases d'eucaryotes supérieurs, humains (Hs.HKDC1, NP_079406.4), Arabidopsis thaliana (At.Hexokinase1, NP_194642.1) et Danio rerio (Dr.Hexokinase-2, NP_998231.1). Protéines hypothétiques de Candida tropicalis (Ct.Hypothetical protein, XP_002549429.1) et Zygosaccharomyces rouxii (Zr.Hypothetical protein, GAV52624.1).

Dans cette étude, nous avons identifié la première kinase GlcNAc de S. cerevisiae, un organisme modèle eucaryote. Jusqu'à présent, les kinases GlcNAc ont été identifiées à partir d'un large éventail d'organismes, y compris des bactéries et des animaux. Cependant, on a pensé que S. cerevisiae n'a pas de kinase GlcNAc, car il n'y a pas de gène similaire aux kinases GlcNAc connues dans l'ensemble du génome. En effet, nous ne pouvions pas prédire que le gène YLR446W sans nom et à fonction inconnue de S. cerevisiae est un gène de la GlcNAc kinase à partir de la séquence d'acides aminés car la similarité de séquence avec les GlcNAc kinases connues est d'environ 20 % ou moins. Ici, nous avons déterminé la propriété biochimique de YLR446Wp et découvert que ce gène code une kinase GlcNAc, et l'avons ainsi nommé Ngk1.

Notre analyse enzymatique a montré que Ngk1 possède une activité kinase pour GlcNAc et Glc, bien que les valeurs de Km pour GlcNAc et Glc soient respectivement de 0, 11 mM et 71 mM (Fig. 4a, b). Considérant que la concentration de glucose intracellulaire dans les cellules de S. cerevisiae est estimée à environ 1,5 mM21, Ngk1 peut ne pas être impliqué dans la phosphorylation du glucose dans les conditions physiologiques. Il existe quelques rapports sur les analyses biochimiques des kinases GlcNAc d'autres organismes; les valeurs Km des kinases GlcNAc de C. albicans et de l'homme ont été rapportées comme étant de 0,38 mM et 0,45 mM, respectivement6,8. Par conséquent, l'affinité de Ngk1 pour GlcNAc est supérieure à celle des autres kinases GlcNAc. Ngk1 n'a montré l'activité kinase d'aucun sucre, à l'exception de GlcNAc et Glc (Fig. 2a, b). La kinase GlcNAc humaine agit sur ManNAc ainsi que sur Glc, bien que dans une moindre mesure que GlcNAc8. D'autre part, C. albicans Nag5 a une activité partielle pour Glc et mannose mais pas pour ManNAc6. Ngk1 a montré l'activité avec tous les sucres nucléotidiques, par exemple GTP, CTP, ITP et UTP (Fig. 5a), suggérant que Ngk1 peut utiliser une large gamme de nucléosides triphosphates comme donneurs de phosphoryle. Bien qu'il existe peu de rapports sur la réactivité des sucres kinases pour divers nucléosides triphosphates, il a été rapporté que CaNag5 ne présentait pas d'activité kinase avec ces sucres nucléotidiques, à l'exception de l'ATP et du CTP5. Pris ensemble, ces résultats suggèrent que la propriété enzymatique des kinases GlcNAc est différente de celles de son espèce. Les kinases GlcNAc de différentes espèces sont distantes phylogénétiquement, tandis que les hexokinases de différentes espèces sont relativement proches (Fig. 6). Par conséquent, les kinases GlcNAc de différentes espèces peuvent être dérivées d'origines lointaines et évoluées de manière unique. Notamment, des gènes similaires à Ngk1 sont conservés dans différents genres de champignons, par exemple Z. rouxii, en tant que protéines inconnues hypothétiques ou fonctionnelles. Ngk1 de S. cerevisiae peut être un indice vers la découverte d'un nouveau groupe de kinases GlcNAc.

La signification physiologique des kinases GlcNAc est obscure, bien que cette enzyme ait été trouvée dans un large éventail d'organismes, des bactéries à l'homme. Chez C. albicans, il a été rapporté que la perturbation de Nag5 provoquait une atténuation de sa virulence chez la souris ainsi qu'une réduction de la croissance sur milieu GlcNAc6. Il est supposé que les kinases GlcNAc des mammifères fournissent une voie de récupération pour la synthèse de l'UDP-GlcNAc en phosphorylant la GlcNAc intracellulaire qui peut être dérivée des lysosomes11, mais peu de preuves expérimentales ont été rapportées. Chez E. coli, NagK est connu pour jouer un rôle dans l'utilisation de la GlcNAc intracellulaire dérivée de la dégradation de la mureine de la paroi cellulaire, puisque la GlcNAc extracellulaire est phosphorylée pendant son transport dans les cellules4. Au moins, Ngk1 de S. cerevisiae peut ne pas contribuer au métabolisme de la GlcNAc pour la glycolyse, car cet organisme ne se développe pas en utilisant la GlcNAc extracellulaire comme source de carbone5. Une possibilité est que Ngk1 puisse contribuer à la biosynthèse UDP-GlcNAc en phosphorylant GlcNAc dans la cellule. Cependant, il est encore incertain que la GlcNAc libre intracellulaire puisse exister de l'extérieur ou de l'intérieur des cellules car les voies d'approvisionnement en GlcNAc intracellulaire n'ont pas été identifiées dans cet organisme. Vraisemblablement, Ngk1 peut être indispensable pour les cellules en croissance végétative en présence de suffisamment de glucose car l'UDP-GlcNAc est synthétisé à partir de Fru-6-P via la voie connue. En fait, les cellules de levure dépourvues de Ngk1 se sont développées normalement en présence de suffisamment de glucose (données non présentées). Étant donné qu'un transcriptome à l'échelle du génome a suggéré que le transcrit de ce gène est régulé positivement pendant la sporulation et la réponse protéique dépliée22,23, Ngk1 peut jouer un rôle dans certaines conditions en tant que voie d'approvisionnement alternative GlcNAc-6-P en tant que précurseur de l'UDP-GlcNAc. Des analyses pour élucider le rôle physiologique de Ngk1 dans S. cerevisiae sont en cours.

Un fragment d'ADN pleine longueur de la région ORF de YLR446W a été amplifié par PCR en utilisant l'ADN génomique de la souche S. cerevisiae BY4742 (Invitrogen, Waltham, MA, USA) comme matrice et des amorces oligonucléotidiques (sens : 5'-ATTTATCATATGACAATTGAAAGCACTCTAGCTCGGG -3' ; sens inverse : 5'-ATTTATCTCGAGTTATTGAACTTGGTTGTCTGATTTGTTCAAGTAGG TG-3'). Le fragment d'ADN amplifié a été digéré avec Nde I et Xho I et ligaturé dans les sites correspondants d'un vecteur pCold II (Takara Bio, Shiga, Japon) à fusionner avec une étiquette His6 à l'extrémité N-terminale. La séquence nucléotidique du plasmide résultant (pColdII-His6-Ngkl) a été confirmée par séquençage d'ADN. Ensuite, E. coli BL21 (DE3) a été transformé avec pColdII-His6-Ngk1, et la protéine recombinante a été exprimée selon le protocole du fabricant. Les cellules ont été récoltées et soniquées sur de la glace dans un tampon Tris – HCl 50 mM (pH 8, 0) contenant du NaCl 150 mM, du fluorure de phénylméthylsulfonyle 1 mM et du dithiothréitol 1 mM. L'extrait acellulaire a été appliqué sur une colonne HisTrap™ HP (GE Healthcare, Chicago, IL, USA) et la protéine a été purifiée selon le protocole du fabricant. La concentration en protéines a été mesurée à l'aide de la solution Protein Assay CBB (Nacalai Tesque, Kyoto, Japon). Les protéines recombinantes de Hxk1, Hxk2, Glk1 et Emi2 ont été préparées comme indiqué précédemment13.

La mutagenèse dirigée de Ngk1 a été réalisée par PCR en utilisant pColdII-His6-Ngk1 comme matrice et les amorces oligonucléotidiques répertoriées dans le tableau supplémentaire S1, selon la procédure décrite pour le kit de mutagenèse dirigée QuikChange (Stratagene, Allemagne). La mutation de chaque plasmide a été confirmée par séquençage d'ADN. En utilisant les plasmides résultants, chaque enzyme mutante de Ngk1 a été exprimée dans E. coli BL21 (DE3) et utilisée pour le dosage enzymatique après purification, comme décrit ci-dessus pour l'enzyme de type sauvage.

La mesure de l'activité glucokinase de Ngk1 a été réalisée par la réaction de couplage de la glucose-6-phosphate déshydrogénase (Oriental Yeast, Tokyo, Japon) avec la conversion de NAD+ en NADH13,24. Le mélange de dosage comprenait 10 mM de glucose, 5 mM d'ATP, 5 mM de MgCl2, 2 mM de NAD+, 50 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 1,6 U/mL de glucose-6-phosphate déshydrogénase et une quantité appropriée de l'enzyme. Pour examiner l'effet des cations divalents, 5 mM de MgCl2 a été remplacé par l'un ou l'autre de la même concentration de CoCl2, MnCl2, ZnCl2, CaCl2 ou par 1 mM d'EDTA. La réaction à 30 °C a été démarrée en ajoutant l'enzyme et suivie en surveillant l'augmentation de l'absorbance à 340 nm pour la production de NADH. Une unité (U) est définie comme la quantité d'enzyme qui catalyse la phosphorylation de 1 μmol de Glc par minute à 30 °C.

Pour examiner la spécificité de substrat de l'enzyme pour différents sucres, une réaction comprenant 10 mM de sucre (soit GlcNAc, glucose, mannose, fructose, galactose, glucosamine, N-acétylmannosamine, UDP-GlcNAc ou N'N'-diacétylchitobiose), 10 mM ATP et 10 mM MgCl2 a été réalisée à 30 ° C dans 50 mM Tris-HC l (pH 8,0) avec ou sans enzyme pendant le temps indiqué. Pour les dosages enzymatiques avec différents nucléosides triphosphates comme donneurs de phosphoryle, l'ATP a été remplacé par l'un ou l'autre des nucléosides triphosphates (GTP, CTP, ITP ou UTP) en utilisant GlcNAc comme substrat de sucre. La réaction a été stoppée par chauffage à 100°C pendant 3 min. Les produits de réaction ont été analysés par TLC et HPLC. Une unité (U) est définie comme la quantité d'enzyme qui catalyse la phosphorylation de 1 μmol de GlcNAc par minute à 30 °C.

Un échantillon (3 µL) a été déposé sur une plaque de gel de silice TLC 60 F254 (Merck, Darmstadt, Allemagne). La plaque a été développée dans du 1-butanol/acide acétique/eau (8/3/2), séchée et trempée dans un réactif de couleur (diphénylamine 2 %, aniline 2 % et acide phosphorique 85 %) avant cuisson à 100 °C pendant 10 min. Glc-6-P, GlcNAc-6-P et GlcNAc commerciaux ont été utilisés comme standards.

Les produits de la réaction ont été analysés par HPLC en utilisant une colonne COSMOSIL HILIC (Nacalai Tesque, Japon) et un détecteur UV à 205 nm. Un mélange de tampon phosphate de sodium (10 mM, pH 7,0) et d'acétonitrile (40:60, v/v) a été utilisé comme phase mobile à un débit de 1,0 mL/min, et la température de la colonne a été réglée à 30 °C. GlcNAc commercial, GlcNAc-6-P, GlcNAc-1-P, ADP et Tris ont été utilisés comme standards. GlcNAc-6-P a été quantifié à partir des zones de pic intégrées. L'ESI-MS a également été réalisée pour déterminer la masse de la molécule présumée être GlcNAc-6-P dans les produits de réaction à l'aide d'un spectromètre de masse LCMS-2010EV (Shimadzu, Kyoto, Japon).

Pour déterminer les paramètres cinétiques, la quantité d'ADP formée par la phosphorylation des sucres a été mesurée à l'aide d'un dosage couplé à la pyruvate kinase et à la lactate déshydrogénase, comme établi précédemment13,24. Le mélange de dosage comprenait six à sept concentrations différentes de GlcNAc (0,031 à 2,0 mM) ou de glucose (7,3 à 500 mM) comme substrat de sucre, 5 mM d'ATP, 5 mM de MgCl2, 5 mM de phosphoénolpyruvate, 0,3 mM de NADH, 50 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 18 U/mL de pyruvate kinase (Oriental Yeast, Japon ), 20 U/mL de lactate déshydrogénase (Oriental Yeast, Japon) et une quantité appropriée de Ngk1. La réaction à 30 ° C a été démarrée en ajoutant Ngk1 et suivie en surveillant la diminution de NADH en absorbance à 340 nm. Les valeurs Km et kcat ont été déterminées par analyse de régression non linéaire avec le logiciel Origin (OriginLab, Northampton, MA, USA).

Les ensembles de données générés et/ou analysés dans cette étude sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

Fructose

Glucose

N-acétylglucosamine

1-phosphate

6-phosphate

Diphosphate d'uridine N-acétylglucosamine

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Nous remercions le Dr Hirotaka Katsuzaki (Université Mie) pour l'analyse MS. Nous remercions également Riki Mizuta pour son support technique. Ce travail a été soutenu financièrement par JSPS KAKENHI No. 22K05380 et en partie par l'Institute for Fermentation, Osaka (Japon) (Grant No. G-2022-2-009).

École supérieure des bioressources, Université de Mie, Tsu, 514-8507, Japon

Midori Umekawa, Ayano Nishikawa, Naoto Isono et Shuichi Karita

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MU a conçu les expériences et écrit le manuscrit ; NI a révisé le manuscrit ; MU, AN et NI ont mené les expériences ; MU et SK ont analysé les résultats. Tous les auteurs ont examiné le manuscrit.

Correspondance à Midori Umekawa.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Umekawa, M., Nishikawa, A., Isono, N. et al. Identification et caractérisation biochimique d'une nouvelle N-acétylglucosamine kinase chez Saccharomyces cerevisiae. Sci Rep 12, 16991 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-21400-3

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Reçu : 09 juin 2022

Accepté : 27 septembre 2022

Publié: 10 octobre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-21400-3

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