Spatio-temporel

Nature Communications volume 13, Numéro d'article : 4906 (2022) Citer cet article

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Les approches de marquage de proximité enzymatiques basées sur des esters activés ou des radicaux phénoxy ont été largement utilisées pour cartographier les protéomes subcellulaires et les interactions protéiques dans les cellules vivantes. Cependant, les esters activés sont peu réactifs, ce qui conduit à un large rayon de marquage et les radicaux phénoxy générés par le traitement au peroxyde peuvent perturber les voies sensibles au redox. Nous rapportons ici une méthode de marquage de proximité dépendant de la photoactivation (PDPL) conçue en attachant génétiquement la protéine photosensibilisante miniSOG à une protéine d'intérêt. Déclenché par la lumière bleue et réglé par le temps d'irradiation, l'oxygène singulet est généré, permettant ensuite le marquage de la sonde d'aniline à résolution spatio-temporelle des résidus d'histidine. Nous démontrons sa haute fidélité grâce à la cartographie des protéomes spécifiques aux organites. La comparaison côte à côte de PDPL avec TurboID révèle une couverture protéomique plus spécifique et plus profonde par PDPL. Nous appliquons en outre PDPL au coactivateur transcriptionnel lié à la maladie BRD4 et E3 ligase Parkin, et découvrons des interacteurs jusque-là inconnus. Grâce au dépistage de la surexpression, deux substrats non signalés Ssu72 et SNW1 sont identifiés pour Parkin, dont les processus de dégradation sont médiés par la voie ubiquitination-protéosome.

La caractérisation précise des réseaux de protéines sous-tend de nombreux processus cellulaires fondamentaux1. Ainsi, une cartographie spatio-temporelle haute fidélité des interactions protéiques fournirait une base moléculaire pour déchiffrer les voies biologiques, les pathologies pathologiques, ainsi que le potentiel de perturbation de ces interactions à des fins thérapeutiques2. À cette fin, des méthodes capables de détecter des interactions transitoires dans des cellules ou des tissus vivants sont très nécessaires. La spectrométrie de masse par purification d'affinité (AP-MS) était historiquement utilisée pour extraire les partenaires de liaison d'une protéine d'intérêt (POI). Avec les progrès des approches de protéomique quantitative, la plus grande base de données de réseaux de protéines Bioplex3.0 basée sur AP-MS a été établie3. Bien que l'AP-MS soit extrêmement puissante, les étapes de lyse et de dilution des cellules dans le flux de travail biaisent contre les interactions de liaison faibles et transitoires et introduisent les artefacts post-lyse, tels que les paires interagissant faussement sans compartimentation avant la lyse4.

Pour tenter de relever ces défis, des acides aminés non naturels (UAA) avec des groupes de réticulation et des plateformes de marquage de proximité enzymatique (PL) (par exemple, APEX et BioID) ont été développés5. Bien que les méthodes UAA aient été appliquées avec succès dans de nombreux scénarios et fournissent des informations sur les liants protéiques directs6, elles nécessitent toujours une optimisation des sites d'insertion UAA. Plus important encore, il s'agit d'une méthode de marquage stœchiométrique dépourvue de renouvellement catalytique de l'événement de marquage. À l'inverse, les méthodes PL enzymatiques telles que la méthode BioID fusionnent une biotine ligase modifiée au POI7, avec activation ultérieure de la biotine pour générer l'intermédiaire réactif ester biotinoyl-AMP. En tant que telle, l'enzyme catalyse et libère un "nuage" de biotine activée, qui marque les résidus de lysine proximaux. Cependant, BioID nécessite plus de 12 h pour obtenir suffisamment de signal d'étiquetage, ce qui empêche son application d'une manière temporellement résolue. En utilisant l'évolution dirigée basée sur l'affichage de la levure, TurboID a été conçu à partir de BioID avec une efficacité beaucoup plus grande, réalisant un marquage efficace de la biotine en 10 min8, permettant d'étudier des processus plus dynamiques. Étant donné que TurboID est hautement actif et que les niveaux endogènes de biotine sont suffisants pour un étiquetage de bas niveau, l'étiquetage de fond devient une préoccupation potentielle lorsqu'un étiquetage fortement amélioré et régulé dans le temps est requis par l'ajout de biotine exogène. De plus, les espèces d'esters activés sont peu réactives (t1/2 ~5 min), ce qui peut conduire à un large rayon de marquage, notamment après la saturation des protéines voisines en biotine5. Dans une approche différente, une fusion génétique de peroxydase d'acide ascorbique modifiée (c.-à-d. APEX) génère des radicaux biotine-phénol lors de l'activation avec H2O2 et réalise le marquage des protéines en une minute9,10. APEX a été largement utilisé pour identifier les protéomes subcellulaires, les complexes de protéines membranaires et les complexes de protéines de signalisation cytosoliques11,12. Cependant, l'exigence de concentrations élevées de peroxyde peut affecter les protéines ou les voies sensibles au redox, perturbant les processus cellulaires.

Par conséquent, de nouvelles méthodes capables de générer des espèces plus réactives pour limiter le rayon de marquage avec une fidélité spatiale et temporelle élevée et sans perturbation significative des voies cellulaires constitueraient un complément important aux méthodes actuelles. Parmi les espèces réactives, l'oxygène singulet a retenu notre attention en raison de sa courte durée de vie et de son rayon de diffusion limité (t1/2 < 0,6 µs dans les cellules)13. Il a été rapporté que l'oxygène singulet oxyde de manière confuse la méthionine, la tyrosine, l'histidine et le tryptophane pour écraser leur polarité14,15, qui sont ligaturés avec des sondes à base d'amine ou de thiol16,17. Même si l'oxygène singulet a été appliqué dans le marquage de l'ARN dans les compartiments subcellulaires18, la réorientation de la stratégie dans le marquage de proximité des POI endogènes reste inexploitée. Ici, nous présentons une plate-forme nommée étiquetage de proximité dépendant de la photoactivation (PDPL), où nous utilisons la lumière bleue pour illuminer un POI fusionné avec un miniSOG photosensibilisateur et déclencher la génération d'oxygène singulet pour oxyder les résidus proximaux, suivie d'une modification des intermédiaires oxydés avec une sonde chimique contenant une amine dans les cellules vivantes. Nous criblons un panel de sondes chimiques pour maximiser la spécificité de marquage et déterminer les sites de modification à l'aide d'un flux de travail protéomique de recherche ouverte. Une comparaison côte à côte de PDPL avec TurboID révèle une couverture protéomique plus spécifique et plus profonde par PDPL. Nous appliquons cette approche à l'étiquetage spécifique aux organelles des protéomes subcellulaires et à l'identification à l'échelle du protéome des partenaires de liaison pour la protéine régulatrice épigénétique liée au cancer BRD4 et la ligase E3 liée à la maladie de Parkinson Parkin, qui valide un réseau d'interacteurs protéiques connus et non signalés. La capacité de PDPL à identifier les substrats E3 dans la grande taille des complexes protéiques représente un scénario où l'identification des liants indirects est nécessaire. Deux substrats Parkin non signalés médiés par la voie ubiquitination-protéosome sont validés in situ.

La thérapie photodynamique (PDT)19 et l'inactivation laser assistée par chromophore (CALI)20, où l'oxygène singulet est produit par photoirradiation du photosensibilisateur, sont capables d'inactiver les protéines cibles ou de déclencher la mort cellulaire. Comme l'oxygène singulet est une espèce hautement réactive avec une distance de diffusion théorique d'environ 70 nm17,18,21, l'oxydation restreinte dans l'espace peut être contrôlée autour du photosensibilisateur. Sur la base de ce concept, nous avons décidé de tirer parti de l'oxygène singulet pour réaliser le marquage de proximité des complexes protéiques dans les cellules vivantes. Nous avons conçu la méthode protéomique chimique PDPL pour incarner quatre caractéristiques : (1) génération catalytique d'oxygène singulet réactif de la même manière que les approches enzymatiques PL ; (2) fournir un étiquetage à résolution temporelle par initiation par illumination lumineuse; (3) permettre un étiquetage à résolution spatiale en modifiant le temps d'irradiation pour régler le rayon d'étiquetage ; (4) éviter l'utilisation de cofacteurs endogènes (par exemple, la biotine) pour réduire le bruit de fond ou l'utilisation de réactifs exogènes hautement perturbateurs (par exemple, les peroxydes) pour minimiser l'impact sur l'environnement cellulaire.

Les photosensibilisateurs peuvent être divisés en deux catégories, y compris les fluorophores à base de petites molécules (par exemple, Rose Bengale, Bleu de méthylène)22 et les petites protéines codées génétiquement (par exemple, miniSOG, KillerRed)23. Pour permettre une conception modulaire, nous avons développé la plate-forme PDPL de première génération en ajoutant une protéine photosensibilisante (PS)24,25 au POI (Fig. 1a). Après un éclairage à la lumière bleue, l'oxygène singulet oxyde les résidus d'acides aminés nucléophiles proximaux, ce qui entraîne une polarité umpolung, qui est électrophile et peut en outre réagir avec une sonde amine nucléophile16,17. Les sondes sont conçues avec une poignée en alcyne, permettant la chimie du clic et le pull-down pour la caractérisation LC-MS/MS.

a Schéma du marquage du complexe protéique médié par miniSOG. Lors d'un éclairage à la lumière bleue, les cellules exprimant miniSOG-POI génèrent de l'oxygène singulet, qui modifie les protéines en interaction plutôt que les protéines non liantes. L'intermédiaire de photo-oxydation est intercepté par un marquage de relais de sonde chimique amine pour former un adduit covalent. Le groupe alcyne sur la sonde chimique permet la chimie de clic pour l'enrichissement pull-down, suivi d'une analyse quantitative par LC-MS/MS. b La structure chimique des sondes amine 1-4. c Analyse représentative sur gel fluorescent du marquage protéomique médié par miniSOG localisé dans les mitochondries avec les sondes 1 à 4 ainsi que la quantification relative basée sur la densitométrie sur gel. Des expériences de contrôle négatif omettant la lumière bleue ou avec des cellules HEK293T sans expression de miniSOG ont été utilisées pour évaluer le marquage signal sur fond des sondes chimiques. n = 2 échantillons biologiquement indépendants. Chaque point représente une réplique biologique. d Détection et quantification représentatives de PDPL à l'aide de la sonde optimisée 3 en présence ou en l'absence des composants PDPL indiqués similaires à c. n = 3 échantillons biologiquement indépendants. Chaque point représente une réplique biologique. La ligne centrale et les moustaches indiquent la moyenne et ± SD. CBB : bleu coomassie brillant. e Imagerie confocale de l'oxygène singulet par un colorant rouge lointain Si-DMA. Barre d'échelle : 10 µm. L'imagerie sur gel et les expériences confocales ont été répétées indépendamment au moins deux fois avec des résultats similaires.

Nous avons commencé par tester les photosensibilisateurs bien développés miniSOG26 et KillerRed23 exprimés de manière stable dans HEK293T pour leur capacité à médier le marquage protéomique, avec la propargyl amine comme sonde chimique (Fig. 1a supplémentaire). L'analyse de fluorescence dans le gel a révélé qu'un marquage à l'échelle du protéome était obtenu avec un miniSOG et un éclairage à la lumière bleue alors qu'aucun produit de marquage évident n'a été observé pour KillerRed. Pour augmenter le rapport signal sur fond, nous avons ensuite testé un panel de sondes chimiques, contenant soit de l'aniline (1 et 3), de la propylamine (2) ou de la benzylamine (4). Nous avons remarqué que les cellules HEK293T seules ont un signal de fond plus élevé par rapport à l'omission de la lumière bleue, probablement en raison du photosensibilisateur endogène riboflavine, le mononucléotide de flavine (FMN)27. Les sondes chimiques 1 et 3 à base d'aniline ont donné une meilleure spécificité, HEK293T exprimant de manière stable miniSOG dans les mitochondries affichant une augmentation > 8 fois du signal pour la sonde 3, tandis que la sonde 2 utilisée dans la méthode de marquage d'ARN CAP-seq n'affichant qu'une augmentation de signal d'environ 2,5 fois, probablement en raison de préférences de réactivité différentes entre l'ARN et la protéine (Fig. 1b, c). De plus, les isomères de la sonde 3 et de la sonde hydrazine (sonde 5, 6, 7) ont également été testés, confirmant que la sonde 3 est la sonde optimisée (Fig. 1b, c supplémentaires). De même, l'analyse de fluorescence en gel a déterminé d'autres paramètres expérimentaux optimisés: longueur d'onde d'éclairage (460 nm), concentration de la sonde chimique (1 mM) et temps d'éclairage (20 min) (Fig. 2a – c supplémentaires). L'omission de tout composant ou étape dans le protocole PDPL a entraîné une inversion significative du signal à l'arrière-plan (Fig. 1d). Notamment, le marquage des protéines a été considérablement réduit en présence d'azide de sodium ou de trolox, qui sont connus pour désactiver l'oxygène singulet28. La présence de D2O, connu pour stabiliser l'oxygène singulet, a amélioré le signal de marquage. Pour étudier la contribution d'autres espèces réactives de l'oxygène à l'étiquetage, le mannitol et la vitamine C, des piégeurs de radicaux hydroxyle et de radicaux superoxyde établis respectivement18,29, ont été ajoutés, mais n'ont pas réduit l'étiquetage. L'ajout de H2O2 plutôt que l'éclairage n'a pas généré de marquage (Fig. 3a supplémentaire). L'imagerie fluorescente de l'oxygène singulet par la sonde Si-DMA a confirmé la présence d'oxygène singulet dans la lignée HEK293T-miniSOG, mais pas dans la lignée parentale HEK293T. De plus, mitoSOX Red n'a pas été en mesure de détecter la génération de superoxyde après illumination (Fig. 1e et Fig. 3b supplémentaire)30. Ces données indiquent fortement que l'oxygène singulet est le principal ROS qui donne lieu au marquage ultérieur du protéome. La cytotoxicité du PDPL, y compris l'éclairage à la lumière bleue et le traitement par sonde chimique, a été évaluée et aucune cytotoxicité significative n'a été observée (Fig. 4a supplémentaire).

Pour explorer le mécanisme de marquage et réaliser l'identification protéomique des complexes protéiques par LC-MS/MS, nous devions d'abord déterminer quels acides aminés étaient modifiés et la masse delta du marquage de la sonde. Il a été rapporté que la méthionine, l'histidine, le tryptophane et la tyrosine sont modifiés par l'oxygène singulet14,15. Nous avons intégré le flux de travail TOP-ABPP31 avec une recherche ouverte impartiale activée par la plateforme de calcul FragPipe basée sur MSFragger32. Après la modification de l'oxygène singulet et le marquage de la sonde chimique, une étiquette de récupération de biotine contenant un lieur clivable a été utilisée pour la chimie du clic, suivie d'un pull-down de neutravidine et d'une digestion à la trypsine. Les peptides modifiés, toujours liés à la résine, ont été photoclivés pour l'analyse LC-MS/MS (Fig. 2a et données supplémentaires 1). Les masses de modification qui se produisent à l'échelle du protéome avec plus de 50 correspondances de spectre peptidique (PSM) sont répertoriées (Fig. 2b). Étonnamment, nous n'avons observé de modification que sur l'histidine, probablement en raison de la forte réactivité de l'histidine oxydée vis-à-vis de la sonde aniline par rapport aux autres acides aminés. Selon le mécanisme publié de l'oxydation de l'histidine par l'oxygène singulet21,33, la structure putative de la masse delta +229 Da correspond à l'adduit de la sonde 3 avec la 2-oxo-histidine après deux oxydations, alors que +247 Da est le produit d'hydrolyse de +229 Da (Fig. 5 supplémentaire). L'évaluation des spectres MS2 montre une identification de haute confiance d'une grande fraction d'ions y et d'ions b, y compris des ions fragments (y et b) qui ont permis l'identification de la modification (Fig. 2c). L'analyse du contexte de séquence local des histidines modifiées par PDPL a révélé une modeste préférence de motif pour les petits résidus hydrophobes en position ± 1 (Fig. 4b supplémentaire). En moyenne, 1,4 histidines par protéine ont été identifiées et ces sites marqués sont bien exposés, déterminés par l'analyse de la surface accessible au solvant (SASA) et de l'accessibilité relative au solvant (RSA) (Fig. 4c, d supplémentaires).

a Un flux de travail impartial pour étudier la sélectivité des résidus à l'aide de la plateforme de calcul FragPipe basée sur MSFragger. Un lieur clivable a été utilisé pour la chimie Click, qui permet le photo-clivage du peptide modifié de la résine de streptavidine. Une recherche ouverte a été déployée pour identifier les masses de modification ainsi que les résidus correspondants. b Les masses de modification qui se produisent à l'échelle du protéome sont attribuées. Le spectre des peptides PSM correspond. c Annotation du spectre MS2 d'un site histidine modifié par la sonde 3. La réaction covalente avec la sonde 3 ajoute +229,0938 Da à l'acide aminé modifié comme exemple représentatif. d Test de mutation pour valider le marquage PDPL. PRDX3 (H155A, H225A) et PRDX1 (H10A, H81A, H169A) ont été transfectés avec leurs plasmides de type sauvage pour la détection anti-Flag. e Un peptide synthétique a été mis à réagir avec du miniSOG purifié en présence de la sonde 3 et le produit correspondant avec Δm +247 et +229 a été annoté dans le spectre LC-MS. f Interaction protéine-protéine in vitro simulée par miniSOG-6xHis-tag et anticorps anti-6xHis. Analyse par Western blot anti-biotine (streptavidine-HRP) et anti-souris du complexe d'anticorps miniSOG-6xHis/anti-6xHis marqué à la sonde 3 en fonction du temps d'irradiation lumineuse. Le marquage des protéines individuelles est indiqué aux poids moléculaires appropriés : chaîne légère LC de l'anticorps ; Chaîne lourde HC de l'anticorps. Ces expériences ont été répétées indépendamment au moins deux fois avec des résultats similaires.

Pour valider biochimiquement les sites de marquage, les histidines de PRDX3 et PRDX1 identifiées en spectrométrie de masse ont été mutées en alanine et comparées au type sauvage dans un test de transfection. Les résultats du PDPL ont montré que les mutations réduisaient considérablement le marquage (Fig. 2d). Pendant ce temps, une séquence peptidique identifiée dans la recherche ouverte a été synthétisée et mise à réagir in vitro avec du miniSOG purifié en présence de la sonde 3 et de la lumière bleue, avec des produits avec décalage de masse +247 et +229 Da apparaissant dans la détection LC-MS (Fig. 2e). Pour tester si les interactions protéiques proximales pouvaient être marquées en réponse à la photoactivation de miniSOG in vitro, nous avons construit un test de proximité artificielle via l'interaction entre la protéine miniSOG-6xHis et l'anticorps monoclonal anti-His in vitro (Fig. 2f). Dans cet essai, nous nous attendions à un marquage proximal des chaînes lourdes et légères de l'anticorps par miniSOG. En effet, l'anti-souris (reconnaissant à la fois les chaînes lourdes et légères de l'anticorps anti-étiquette 6xHis) et la streptavidine Western blot ont révélé une biotinylation robuste des chaînes lourdes et légères. Notamment, nous avons remarqué l'auto-biotinylation de miniSOG due à l'étiquette 6xHis ainsi qu'une réticulation entre la chaîne légère et la chaîne lourde, probablement en raison de la réaction proximale entre la lysine et la 2-oxo-histidine, qui a déjà été rapportée34. Pris ensemble, nous avons conclu que PDPL modifie l'histidine d'une manière dépendante de la proximité.

Notre prochain objectif était de caractériser les protéomes subcellulaires pour tester la spécificité de marquage in situ. Nous avons donc exprimé de manière stable le miniSOG dans le noyau, la matrice mitochondriale ou la membrane externe du RE des cellules HEK293T (Fig. 3a). L'analyse de fluorescence dans le gel a révélé d'abondantes bandes de marquage ainsi que différents modèles de marquage dans les trois emplacements subcellulaires (Fig. 3b). L'analyse par imagerie fluorescente a révélé une spécificité élevée de PDPL (Fig. 3c). Le flux de travail PDPL suivi d'une réaction de clic avec un colorant à la rhodamine a été utilisé pour délimiter les protéomes subcellulaires par microscopie à fluorescence, avec un signal PDPL co-localisé avec DAPI, un tracker mitochondrial ou un tracker ER, validant la haute fidélité du PDPL. Pour trois emplacements d'organites, une comparaison côte à côte de PDPL avec TurboID en utilisant un Western blot anti-biotine a révélé un étiquetage plus spécifique par PDPL par rapport à leurs témoins respectifs. Plus de bandes de marquage sont apparues dans les conditions PDPL, indiquant plus de protéines marquées par PDPL (Fig. 6a – d supplémentaires).

a Schéma du marquage protéomique spécifique aux organites médié par miniSOG. miniSOG est génétiquement ciblé sur la matrice mitochondriale via la fusion aux 23 acides aminés N-terminaux de la COX4 humaine (mito-miniSOG), sur le noyau via la fusion avec H2B (noyau-miniSOG) et sur le côté cytoplasmique de la membrane ER via la fusion avec Sec61β (ER-miniSOG). La lecture comprend l'imagerie sur gel, l'imagerie confocale et la spectrométrie de masse. b Imagerie sur gel représentative de trois profils PDPL spécifiques aux organites. CBB coomassie bleu brillant. c Imagerie confocale représentative de cellules HEK293T exprimant de manière stable différents miniSOG localisés sous-cellulaires, qui ont été détectés avec l'anticorps V5 tag (rouge). Des marqueurs subcellulaires sont utilisés pour les mitochondries et le RE (vert). Le flux de travail PDPL implique une chimie de clic avec Cy3-azide pour détecter les protéomes subcellulaires marqués miniSOG (jaune). Barre d'échelle : 10 µm. d Parcelles volcaniques de protéomes marqués au PDPL dans différents organites quantifiés par quantification sans étiquette (n = 3 expériences biologiques indépendantes). Un test t de Student bilatéral a été utilisé dans le tracé du volcan. HEK293T de type sauvage a été utilisé comme contrôle négatif. Les protéines significativement modifiées sont surlignées en rouge (p < 0,05 et > 2 fois la différence d'intensité des ions). Les protéines pertinentes qui sont significatives dans HEK293T-miniSOG mais pas dans HEK293T sont marquées en vert. e Analyse de spécificité pour les ensembles de données protéomiques dérivés d'expériences en d. Le nombre total de protéines statistiquement significatives dans chaque organite (points rouges et verts) a été étiqueté en haut. Les barres montrent des protéines localisées dans les organites basées sur MitoCarta 3.0, analyse GO et A. Ting et. Al. ensemble de données pour mitochondrial, noyau et ER, respectivement. Ces expériences ont été répétées indépendamment au moins deux fois avec des résultats similaires. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Encouragée par les résultats du gel et de l'imagerie, une quantification sans étiquette a été utilisée pour quantifier les protéomes identifiés dans chaque organite (Données supplémentaires 2). HEK293T non transfecté a été utilisé comme contrôle négatif pour déduire le marquage de fond. L'analyse des parcelles volcaniques a montré des protéines significativement enrichies (p <0, 05 et> 2 fois l'intensité des ions) ainsi que des protéines singleton qui ne sont présentes que dans les lignées exprimant miniSOG (Fig. 3d points rouges et verts). En combinant ces données, nous avons identifié 1364, 461 et 911 protéines statistiquement significatives pour le noyau, les mitochondries et la membrane externe du RE, respectivement. Pour analyser la précision de la PDPL localisée dans les organites, nous avons utilisé MitoCarta 3.0, l'analyse de l'ontologie génétique (GO) et l'analyse A. Ting et al. ensemble de données8 pour les mitochondries, le noyau et le RE pour valider la spécificité des organites des protéines détectées, ce qui correspondait à une précision de 73, 4, 78, 5 et 73, 0% (Fig. 3e). La spécificité de PDPL valide que PDPL est un outil idéal pour identifier les protéomes spécifiques aux organelles. Notamment, l'analyse subochondriale des protéines mitochondriales identifiées a révélé que le protéome capturé était principalement distribué dans la matrice et la membrane interne (226 et 106, respectivement), représentant 91,7% du total des protéines mitochondriales identifiées (362), ce qui a confirmé la haute fidélité du PDPL (Fig. 7a supplémentaire). De même, l'analyse sous-nucléaire a révélé que le protéome capturé était principalement distribué dans le noyau, le nucléoplasme et le nucléole (Fig. 7b supplémentaire). Le profilage du protéome du noyau par le peptide de signaux de localisation nucléaire (3xNLS) a révélé une précision similaire à la construction H2B (Fig. 7c – h supplémentaire). Pour définir la spécificité d'étiquetage de PDPL, la Lamin A nucléaire a été sélectionnée comme appât POI plus discrètement localisé. PDPL a identifié 36 protéines significativement enrichies, dont 12 protéines (30,0 %, y compris Lamin A) étant des protéines interagissant avec Lamin A bien caractérisées annotées par la base de données String, ce qui représente un pourcentage plus élevé que la méthode BioID (28 protéines sur 122, 22,9 %)7. Notre méthode a identifié moins de protéines, probablement en raison de la zone d'étiquetage restreinte, rendue possible par l'oxygène singulet plus réactif. L'analyse GO révèle que les protéines identifiées sont principalement situées dans le nucléoplasme (26), l'enveloppe nucléaire (10), la membrane nucléaire (9) et le pore nucléaire (5). Combinées, ces protéines localisées dans le noyau représentent 80% des protéines enrichies, démontrant davantage la spécificité de PDPL (Fig. Supplémentaire 8a – d).

Après avoir établi la capacité de PDPL pour l'étiquetage de proximité dans les organites, nous avons ensuite testé si PDPL pouvait être utilisé pour profiler les partenaires de liaison d'un POI. En particulier, nous avons cherché à déterminer le profilage PDPL des protéines cytosoliques, qui étaient considérées comme des cibles plus difficiles par rapport à leurs homologues localisées sur la membrane en raison de leur nature hautement dynamique12. La protéine bromodomaine et extraterminale (BET) BRD4 a attiré notre attention pour son rôle critique dans diverses maladies35,36. Les complexes formés par BRD4 sont des coactivateurs transcriptionnels et des cibles thérapeutiques importantes. En régulant l'expression du facteur de transcription c-myc et Wnt5a, BRD4 est considéré comme un déterminant clé dans la leucémie myéloïde aiguë (LMA), le myélome multiple, le lymphome de Burkitt, le cancer du côlon et les maladies inflammatoires37,38. De plus, plusieurs virus ciblent BRD4 pour réguler la transcription virale et cellulaire, comme le papillomavirus, le VIH et le SRAS-CoV-236,39.

Pour déterminer une carte d'interaction de BRD4 à l'aide de PDPL, nous avons fusionné miniSOG à l'isoforme courte de BRD4 à l'extrémité N ou C-terminale. Les résultats protéomiques ont révélé un chevauchement élevé entre les deux constructions (Fig. 9a supplémentaire). Le protéome nucléaire déterminé par miniSOG-H2B couvrait 77, 6% des protéines interagissant avec BRD4 (Fig. 9b supplémentaire). Ensuite, différents points de temps d'éclairage (2, 5, 10, 20 min) ont été utilisés pour réguler le rayon d'étiquetage (Fig. 4a et données supplémentaires 3). Nous avons estimé qu'à un temps d'illumination plus court, PDPL marquerait principalement des partenaires de liaison directs, tandis que des temps longs incluraient des protéines identifiées dans la période de photoactivation plus courte ainsi que des cibles indirectes d'étiquettes dans des complexes. En effet, nous avons trouvé un chevauchement élevé entre les points de temps adjacents (84,6 % pour 2 contre 5 min ; 87,7 % pour 5 contre 10 min ; 98,7 % pour 10 contre 20 min) (Fig. 4b et Supplémentaire Fig. 9c). Dans tous les groupes expérimentaux, nous avons non seulement détecté l'auto-étiquetage de BRD4, mais également plusieurs de ses cibles connues, telles que MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A et HMGB1, comme indiqué dans la base de données String. L'intensité ionique de ces cibles est proportionnelle au temps d'éclairage (Fig. 4c et Fig. 9d supplémentaire). L'analyse GO des protéines identifiées dans le groupe de 2 min a révélé que les protéines identifiées sont localisées dans le noyau et participent au remodelage de la chromatine et à la fonction de l'ARN polymérase. Les fonctions moléculaires des protéines ont été enrichies en liaison à la chromatine ou en coactivation de la transcription, conformément à la fonction de BRD4 (Fig. 4d). L'analyse de l'interaction des protéines activée par la base de données String a révélé la première couche d'interaction indirecte entre les complexes d'interaction de la famille BRD4 et HDAC, tels que SIN3A, NCOR2, BCOR et SAP130 (Fig. 4e et Fig. 9e supplémentaire), conformément à la fois à BRD4 et aux HDACs liant les histones acétylées. De plus, des cibles représentatives telles que Sin3A, NSUN2, Fus et SFPQ identifiées par LC-MS/MS ont été validées par Western blot (Fig. 4f). Récemment, il a été rapporté qu'une courte isoforme de BRD4 formait des points nucléaires possédant des propriétés de séparation de phase liquide-liquide (LLPS)40. Les protéines de liaison à l'ARN Fus et SFPQ, qui interviennent dans la LLPS pour une variété de processus cellulaires41, ont été identifiées ici comme des protéines de liaison BRD4 non rapportées. Des expériences de co-immunoprécipitation (co-IP) ont vérifié l'interaction entre BRD4 et SFPQ (Fig. 4g), indiquant un mécanisme différent de séparation de phases liquide-liquide médiée par BRD4 et justifiant une enquête plus approfondie. Pris ensemble, ces résultats démontrent que PDPL est une plate-forme idéale pour identifier les interacteurs BRD4 connus ainsi que les protéines de liaison non signalées.

a Schéma du marquage de proximité BRD4 médié par miniSOG avec temps d'irradiation : 2, 5, 10 et 20 min. b Chevauchement des protéines identifiées pour différents points de temps d'illumination. L'enrichissement des protéines identifiées est statistiquement significatif dans HEK293T-miniSOG-BRD4 par rapport à HEK293T de type sauvage. c L'intensité ionique dans la quantification sans étiquette pour les protéines de liaison BRD4 connues représentatives sur les durées d'irradiation indiquées. n = 3 échantillons biologiquement indépendants. Les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes ± ET. d Analyse de l'ontologie génique (GO) des protéines identifiées dans le groupe de 2 min. Les dix principaux termes GO sont répertoriés. Les bulles sont colorées selon la classe de termes GO et la taille des bulles est proportionnelle au nombre de protéines trouvées dans chaque terme. e Analyse des chaînes de protéines interagissant avec BRD4. Les cercles jaunes sont des liants directs et les cercles gris sont dans la première couche de liants indirects. Les lignes rouges indiquent les interactions déterminées expérimentalement et les lignes cyan indiquent les interactions prévues. f Les cibles de liaison BRD4 représentatives identifiées en LC-MS/MS ont été validées par Western blot. g Des expériences de co-immunoprécipitation ont vérifié l'interaction entre SFPQ et BRD4. Ces expériences ont été répétées indépendamment au moins deux fois avec des résultats similaires. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

En plus d'identifier les cibles de liaison non signalées de POI, nous avons envisagé que le PDPL conviendrait à l'identification des substrats d'enzymes, ce qui nécessite la caractérisation des protéines de liaison indirecte dans un grand complexe pour annoter les substrats non signalés. Parkin (codée par PARK2) est une ligase E3, et des mutations de Parkin sont connues pour provoquer la maladie de Parkinson juvénile autosomique récessive (AR-JP)42. De plus, Parkin est décrit comme étant crucial pour la mitophagie (autophagie des mitochondries) et la clairance des espèces réactives de l'oxygène43. Cependant, la fonction de Parkin dans cette maladie n'est pas claire malgré l'identification de plusieurs de ses substrats. Pour annoter ses substrats non caractérisés, PDPL a été testé en incorporant miniSOG aux extrémités N ou C de Parkin. Les cellules ont été traitées avec du protonophore carbonyl cyanure m-chlorophényl hydrazone (CCCP) pour activer Parkin via la voie PINK1-Parkin. Contrairement à nos résultats BRD4 PDPL, la fusion Parkin N-terminale a identifié un ensemble beaucoup plus large de cibles protéiques, même si elle couvre la majeure partie du C-terminal (177 sur 210) (Fig. 5a, b et Données supplémentaires 4). Ce résultat est conforme au rapport selon lequel le marquage N-terminal peut activer de manière aberrante Parkin44. Étonnamment, nos données ne contiennent que 18 protéines qui se chevauchent avec les résultats AP-MS publiés pour Parkin43, probablement en raison de différences entre les lignées cellulaires et les flux de travail protéomiques. PDPL a pu identifier exclusivement 11 liants connus de Parkin (ATXN2, IKBKG, PSMD4, TP53, SUMO1, PSMD9, STUB1, PSMD4, DNAJB1, UBE2Z et EPS15), en plus de quatre protéines connues identifiées par les deux approches (ARDM1, HSPA8, PSMD14 et PSMC3) (Fig. 5c)43. Pour valider davantage les résultats LC-MS/MS, le traitement PDPL et l'analyse Western blot ultérieure ont été utilisés pour comparer les résultats déroulants pour les cellules parentales HEK293T et la lignée stable Parkin N-terminale. Les cibles auparavant inconnues CDK2, DUT, CTBP1 et PSMC4 ont été validées avec le liant connu DNAJB1 (Fig. 5d).

a Parcelles volcaniques de protéines interagissant avec Parkin dans des cellules HEK293T avec un miniSOG exprimé de manière stable fusionné à l'extrémité N-terminale ou C-terminale de Parkin (n = 3 expériences biologiques indépendantes). Un test t de Student bilatéral a été utilisé dans le tracé du volcan. HEK293T a été utilisé comme contrôle négatif. Les protéines significativement modifiées sont surlignées en rouge (p < 0,05 et > 2 fois la différence d'intensité des ions). Les protéines pertinentes qui sont significatives dans HEK293T-miniSOG mais pas dans HEK293T sont marquées en vert. b Diagramme de Venn montrant des protéines qui se chevauchent entre les constructions N-terminales et C-terminales. Le marquage N-terminal peut activer de manière aberrante Parkin et conduire à davantage de protéines identifiées. c Diagramme de Venn montrant des protéines qui se chevauchent entre PDPL et AP-MS. Les interacteurs connus sont répertoriés, y compris quatre protéines sur 18 protéines superposées, ainsi que 11 protéines sur 159 exclusivement identifiées dans PDPL. d Les cibles représentatives identifiées par LC-MS/MS ont été validées par Western blot. e Ssu72 et SNW1 ont été identifiés comme des substrats non signalés de Parkin. Les plasmides avec ces protéines marquées avec FLAG ont été transfectés dans HEK293T et HEK293T-Parkin-miniSOG, suivis d'un traitement CCCP à différents moments. La dégradation est plus importante dans la lignée surexprimant Parkin. f Il a été confirmé que le processus de dégradation de Ssu72 et SNW1 était médié par la voie d'ubiquitination-protéasome en utilisant l'inhibiteur de protéasome MG132. Ces expériences ont été répétées indépendamment au moins deux fois avec des résultats similaires. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Notamment, les protéines identifiées par PDPL devraient inclure des protéines de liaison de Parkin ainsi que ses substrats. Pour découvrir des substrats non signalés de Parkin, nous avons sélectionné sept protéines identifiées (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 et SNW1) et des plasmides transfectés, mettant à nu ces gènes dans HEK293T normal ainsi que HEK293T exprimant de manière stable miniSOG-Parkin, suivi d'un traitement CCCP. Les niveaux de protéines Ssu72 et SNW1 ont été significativement diminués dans les lignées stables miniSOG-Parkin (Fig. 5e). Le traitement CCCP pendant 12 h a donné la dégradation la plus significative des deux substrats. Pour déterminer si la dégradation de Ssu72 et de SNW1 était régulée par la voie de l'ubiquitination-protéasome, l'inhibiteur de protéasome MG132 a été ajouté pour inhiber l'activité du protéasome et, en effet, nous avons constaté que leur processus de dégradation était inhibé (Fig. 5f). Les autres cibles sans substrat ont été validées en tant qu'interacteurs de Parkin à l'aide de Western blot (Fig. 10 supplémentaire), qui ont montré des résultats cohérents avec LC-MS/MS. Pris ensemble, l'intégration du flux de travail PDPL avec la validation de la transfection de la protéine cible est capable d'identifier les substrats non signalés pour les ligases E3.

Nous avons développé une plate-forme générale d'étiquetage de proximité qui permet l'identification à résolution spatio-temporelle d'interacteurs de POI. Cette plate-forme est basée sur la protéine photosensibilisante miniSOG, qui ne fait que ~ 12 kD, moins de la moitié de la taille de l'enzyme bien développée APEX2 (27 kD) et un tiers de la taille de TurboID (35 kD). La plus petite taille devrait considérablement élargir le champ d'application pour l'étude de l'interactome des petites protéines. L'exploration future de photosensibilisateurs supplémentaires, à la fois des protéines codées génétiquement ou de petites molécules45, est justifiée pour augmenter le rendement quantique d'oxygène singulet et élargir la sensibilité de cette approche. Pour la version miniSOG actuelle, l'utilisation d'un éclairage de lumière bleue pour initier l'étiquetage de proximité permet une résolution temporelle élevée. De plus, des périodes d'irradiation plus longues libèrent un plus grand "nuage" d'oxygène singulet, conduisant à la modification de résidus d'histidine plus distaux, élargissant le rayon d'étiquetage et permettant un réglage fin de la résolution spatiale de PDPL. Nous avons également criblé sept sondes chimiques pour augmenter le rapport signal sur fond et exploré le mécanisme moléculaire sous-jacent à cette approche. Le flux de travail TOP-ABPP couplé à une recherche ouverte impartiale a confirmé que la modification ne s'est produite qu'au niveau de l'histidine et qu'aucun microenvironnement cohérent n'a été observé pour une modification accrue de l'histidine, en plus d'une préférence modeste pour l'histidine dans les régions de boucle.

Le PDPL a également été utilisé pour caractériser les protéomes subcellulaires, où la spécificité et la couverture du protéome étaient au moins comparables à d'autres méthodes de marquage de proximité et à des méthodes basées sur des sondes chimiques spécifiques aux organelles. L'étiquetage de proximité a également été appliqué avec succès pour caractériser le surfacome, le protéome du lysosome et les protéomes associés à la voie de sécrétion46,47. Nous pensons que PDPL serait compatible avec ces organites subcellulaires. De plus, nous avons défié PDPL avec l'identification de cibles de liaison aux protéines cytosoliques, ce qui est plus difficile que les protéines liées à la membrane en raison de leur nature dynamique et de leur implication dans des interactions plus transitoires. PDPL a été appliqué à deux protéines, le coactivateur transcriptionnel BRD4 et la ligase Parkine E3 liée à la maladie. Ces deux protéines ont été sélectionnées non seulement pour leurs fonctions biologiques fondamentales mais aussi pour leur pertinence clinique et leur potentiel thérapeutique. Des partenaires de liaison bien connus, ainsi que des cibles non signalées, ont été identifiés pour les deux points d'intérêt. Notamment, une protéine SFPQ liée à la séparation de phase a été validée par un co-IP, ce qui peut indiquer un nouveau mécanisme dans lequel BRD4 (isoforme courte) régule LLPS. Pendant ce temps, l'identification des substrats Parkin, selon nous, est un scénario dans lequel l'identification des liants indirects est nécessaire. Nous avons identifié deux substrats Parkin non rapportés et validé leur dégradation par la voie ubiquitination-protéosome. Très récemment, une stratégie de piège basée sur un mécanisme a été développée pour découvrir des substrats d'hydrolase en capturant les substrats avec l'enzyme48. Bien qu'il s'agisse d'une approche extrêmement puissante, elle ne convient pas au profilage des substrats impliqués dans la formation de grands complexes et nécessite la formation d'une liaison covalente entre les enzymes et les substrats. Nous prévoyons que PDPL pourrait être étendu à l'étude d'autres complexes protéiques et familles d'enzymes, telles que les familles des déubiquitinases et des métalloprotéases.

Une nouvelle forme de miniSOG, appelée SOPP3, a été conçue avec un meilleur rendement en oxygène singulet49. Nous avons comparé miniSOG à SOPP3 et constaté que l'efficacité de l'étiquetage était augmentée, bien que le rapport signal sur bruit soit resté inchangé (Fig. 11 supplémentaire). Nous postulons que l'optimisation SOPP3 (par exemple, via une évolution dirigée) se traduirait par une protéine photosensibilisant plus efficace nécessitant un temps d'illumination beaucoup plus court, permettant la capture de processus cellulaires plus dynamiques. Notamment, la version actuelle de PDPL est limitée à l'environnement cellulaire car elle nécessite un éclairage à la lumière bleue, qui n'est pas pénétrable dans les tissus profonds. Cette caractéristique empêche son utilité dans les études de modèles animaux. Cependant, les technologies optogénétiques couplées au PDPL pourraient fournir une piste d'étude animale50, en particulier dans le cerveau. De plus, d'autres photosensibilisateurs infrarouges techniques atténueraient également cette limitation. Des recherches dans ce sens sont actuellement en cours.

La lignée cellulaire HEK293T a été obtenue auprès de l'ATCC (CRL-3216). La lignée cellulaire a été testée négative pour la contamination par les mycoplasmes et a été cultivée dans du DMEM (Thermo, #C11995500BT) additionné de 10 % de sérum bovin fœtal (FBS, Vistech, #SE100-B) et de 1 % de pénicilline/streptomycine (Hyclone, #SV30010).

Le 3-aminophénylène (sonde 3) et la (4-éthynylphényl)méthanamine (sonde 4) ont été achetés chez Bidepharm. La propylamine (sonde 2) a été achetée chez Energy-chemicals. Le N-(2-aminophényl)pent-4-ynamide (sonde 1) a été synthétisé selon une procédure publiée51.

Le tableau supplémentaire 1 répertorie les constructions génétiques utilisées dans cette étude. Les séquences miniSOG et KillerRed ont été clonées à partir de plasmides cadeaux de P. Zou (Peking University). La séquence de ciblage de la matrice mitochondriale a été dérivée des 23 acides aminés N-terminaux de COX4, puis clonée dans des vecteurs spécifiés par assemblage Gibson (Beyotime, #D7010S). En ce qui concerne le ciblage de la membrane et du noyau du réticulum endoplasmique, l'ADN humain SEC61B (NM_006808.3) amplifié par PCR (NEB, #M0491L) à partir de la bibliothèque d'ADNc de cellules HEK293T et de l'ADN H2B (un cadeau de D. Lin du Laboratoire de la baie de Shenzhen) a été utilisé et cloné comme ci-dessus. D'autres gènes de protéines utilisés dans la transfection et la construction de lignées cellulaires stables ont été amplifiés par PCR à partir de la bibliothèque d'ADNc de cellules HEK293T, sauf mention contraire. G3S (GGGS) et G4S (GGGGS) ont été utilisés comme lieurs entre la protéine appât et miniSOG. Une étiquette d'épitope V5 (GKPIPNPLLGLDST) a été ajoutée à ces constructions de fusion. Pour l'expression mammalienne et la création de lignées cellulaires stables, des constructions de fusion miniSOG ont été sous-clonées dans un vecteur lentiviral pLX304. Pour l'expression bactérienne, miniSOG a été cloné dans un vecteur pET21a avec 6xHis-tag à l'extrémité C-terminale.

Les cellules HEK293T ont été ensemencées dans une plaque à six puits à 2, 0 × 105 cellules par puits et transfectées après 24 h avec un plasmide lentiviral recombinant (2, 4 μg pLX304) et des plasmides d'emballage de virus (1, 5 μg psPAX2 et 1, 2 μg pMD2.G) en utilisant Lipo8000 (Beyotime, # C0533) à ~ 80% de confluence. Après transfection pendant la nuit, les milieux ont été échangés et laissés à incuber pendant 24 h supplémentaires. La collecte virale a été réalisée à 24, 48 et 72 h. Le milieu viral a été filtré avec un filtre de 0,8 μm (Merck, #millex-GP) et du Polybrene (Solarbio, #H8761) a été ajouté à une concentration de 8 μg/mL avant l'infection des lignées cellulaires cibles. Après 24 h, les cellules ont été autorisées à récupérer en échangeant les milieux. Les cellules ont été sélectionnées avec Blasticidin (Solarbio, #3513-03-9) à 5 μg/mL pour les trois premiers passages comme sélection de stringence inférieure. Ensuite, 20 μg/mL ont été utilisés comme stringence plus élevée pour les trois passages suivants.

Les cellules ont été ensemencées dans une chambre à 12 puits (Ibidi, #81201) à une densité d'environ 20 000 cellules par puits. Pour améliorer l'adhérence des cellules HEK293T, les chambres ont été prétraitées avec 50 μg/ml de fibronectine (Corning, #356008) diluée dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS, Sangon, #B640435) pendant 1 h à 37 °C et éliminées par PBS. Après 24 h, les cellules ont été lavées avec du PBS une fois, incubées avec 1 mM de sonde 3 dans une solution saline équilibrée de Hanks fraîche (HBSS, Gibco, # 14025092) pendant 1 h à 37 ° C, puis éclairées avec une LED bleue (460 nm) pendant 10 min à température ambiante. Ensuite, les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS et fixées avec du formaldéhyde à 4 % (Sangon, #E672002) dans du PBS à température ambiante pendant 15 min. Le formaldéhyde en excès a été éliminé des cellules fixées par lavage avec du PBS trois fois. Les cellules ont ensuite été perméabilisées avec du Triton X-100 à 0,5 % (Sangon, #A600198) dans du PBS, puis lavées trois fois de plus avec du PBS. Ensuite, la chambre a été retirée et 25 μL de réactifs de réaction de clic ont été ajoutés à chaque échantillon, contenant 50 μM de Cy3-azide (Aladdin, #C196720), 2 mM de CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM de BTTAA (Confluore, #BDJ-4) et 0,5 mg/ml d'ascorbate de sodium (Aladdin, #S105024), et incuber à température ambiante pendant 30 min. Après la réaction de clic, les cellules ont été lavées six fois avec du PBS contenant 0,05 % de Tween-20 (Sangon, # A600560) (PBST), puis bloquées avec 5 % de BSA (Abcone, # B24726) dans du PBST pendant 30 min à température ambiante.

Pour l'immunomarquage permettant l'analyse de colocalisation, les cellules ont été incubées avec des anticorps primaires selon les conditions indiquées : anticorps monoclonal de souris anti-tag V5 (1:500, CST, #80076), anticorps monoclonal de lapin anti-Hsp60 (1:1000, ABclonal, #A0564), anticorps polyclonal de lapin anti-calnexine (1:500, Abcam, #ab22595) ou monoclonal de lapin anti-Lamin A/C anticorps clonal (1:500; CST, #2032) pendant une nuit à 4 °C. Après trois lavages avec du PBST, les cellules ont été incubées avec un anticorps secondaire : chèvre anti-lapin Alexa Fluor 488 (Thermo, #A11034) à une dilution de 1:1000, chèvre anti-souris Alexa Fluor 594 (CST, #8889) à une dilution de 1:1000 pendant 30 min à température ambiante. Les cellules ont ensuite été lavées trois fois avec du PBST et contre-colorées avec du DAPI (Thermo, # D1306) dans du PBS pendant 10 min à température ambiante. Les cellules ont été scellées dans du glycérol à 50 % (Sangon, #A600232) dans du PBS pour l'imagerie après trois lavages avec du PBS. Les images d'immunofluorescence ont été collectées avec le microscope confocal ZEISS LSM 900 Airyscan2 avec le logiciel ZNE 3.5.

Pour l'imagerie fluorescente de l'oxygène singulet, les cellules ont été lavées deux fois avec le tampon HEPES de Hanks, puis 100 nM de Si-DMA (DOJINDO, #MT05) dans le tampon HEPES de Hanks ont été ajoutés. Après illumination, les cellules ont été cultivées pendant 45 min dans un incubateur à CO2 à 37°C. Ensuite, les cellules ont été lavées deux fois avec le tampon HEPES de Hanks et contre-colorées avec Hoechst dans le tampon HEPES de Hanks pendant 10 min à température ambiante et imagées avec un microscope confocal ZEISS LSM 900. Pour l'imagerie fluorescente du superoxyde, un indicateur de superoxyde mitochondrial rouge MitoSOX ™ 5 μM (Invitrogen, # M36008) dans un tampon HBSS contenant du calcium et du magnésium a été ajouté aux cellules. Après illumination ou traitement à la doxorubicine (MCE, #HY-15142A), les cellules ont été cultivées pendant 10 min dans un incubateur à CO2 à 37 ° C, lavées deux fois avec du tampon HBSS et contre-colorées avec du Hoechst dans du tampon HBSS pendant 10 min à température ambiante. La doxorubicine a été utilisée comme témoin positif pour la sonde où les cellules ont été traitées avec 20 μM de doxorubicine dans du HBSS contenant 1 % de BSA pendant 30 min. Les images d'immunofluorescence ont été recueillies avec le microscope confocal ZEISS LSM 900.

Des cellules HEK293T exprimant de manière stable mito-miniSOG ont été ensemencées dans des boîtes de 15 cm à une densité d'environ 30 %. Après 48 h, lorsqu'elles ont atteint une confluence d'environ 80 %, les cellules ont été lavées avec du PBS une fois, incubées avec 1 mM de sonde 3 dans du tampon HBSS frais pendant 1 h à 37 °C, puis éclairées avec une LED bleue pendant 10 min à température ambiante. Ensuite, les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS, grattées et remises en suspension dans un tampon PBS glacé contenant un inhibiteur de protéase sans EDTA (MCE, # HY-K0011). Les cellules ont été lysées par sonication de la pointe pendant 1 min (1 s allumée et 1 s éteinte, amplitude 35%). Le mélange résultant a été centrifugé à 15 871 × g pendant 10 min à 4 ° C pour éliminer les débris et la concentration du surnageant a été ajustée à 4 mg / ml à l'aide d'un kit de dosage de protéines BCA (Beyotime, # P0009). 1 ml du lysat ci-dessus a été incubé avec 0, 1 mM d'azide de biotine photo-clivable (Confluore, # BBBD-14), 1 mM de TCEP (Sangon, # A600974), 0, 1 mM de TBTA (Aladdin, # T162437) ligand et 1 mM CuSO4 pendant 1 h avec rotation ascendante à température ambiante. Après la réaction de clic, le mélange a été ajouté à une solution pré-mélangée (MeOH : CHCl3 : H2O = 4 ml : 1 ml : 3 ml) dans une bouteille en verre de 10 ml. Les échantillons ont été mélangés et centrifugés à 4500 xg pendant 10 min à température ambiante. La solution des couches inférieure et supérieure a été jetée séquentiellement, et le culot a ensuite été lavé deux fois avec 1 ml de méthanol, puis centrifugé à 15 871 x g pendant 5 min à 4 ° C. 1 ml d'urée 8 M (Aladdin, #U111902) dans du bicarbonate d'ammonium 25 mM (ABC, Aladdin, #A110539) a été ajouté pour dissoudre le culot. Les échantillons ont été réduits avec du dithiothréitol 10 mM (Sangon, # A100281, dans ABC 25 mM) à 55 ° C pendant 40 min, puis alkylés en ajoutant de l'iodoacétamide frais 15 mM (Sangon, # A600539) dans l'obscurité à température ambiante pendant 30 min. 5 mM supplémentaires de dithiothréitol ont été ajoutés pour arrêter la réaction. Environ 100 μL de billes de résine d'agarose NeutrAvidin (Thermo, #29202) pour chaque échantillon ont été préparées en lavant trois fois avec 1 mL de PBS. La solution de protéome ci-dessus a été diluée avec 5 ml de PBS et incubée avec des billes de résine d'agarose NeutrAvidin prélavées pendant 4 h à température ambiante. Ensuite, les billes ont été lavées avec 5 ml de PBS contenant 0,2 % de SDS (Sangon, #A600485) trois fois, 5 ml de PBS contenant 1 M d'urée trois fois et 5 ml de ddH2O trois fois. Les billes ont ensuite été collectées par centrifugation et remises en suspension dans 200 μL d'ABC 25 mM contenant 1 M d'urée, 1 mM de CaCl2 (Macklin, #C805228) et 20 ng/μL de trypsine (Promega, #V5280). La digestion à la trypsine a été effectuée à 37°C avec rotation pendant une nuit. La réaction a été désactivée en ajoutant de l'acide formique (Thermo, # A117-50) jusqu'à ce que le pH atteigne 2–3. Les billes ont été lavées trois fois avec 1 ml de PBS contenant 0,2 % de SDS, 1 ml de PBS contenant 1 M d'urée trois fois, puis trois fois 1 ml d'eau distillée. Libération des peptides modifiés par photo clivage (365 nm) pendant 90 min avec 200 μL 70% MeOH. Après centrifugation, le surnageant a été récupéré. Ensuite, les billes ont été lavées une fois avec 100 μL de MeOH à 70 % et le surnageant a été combiné. Les échantillons ont été séchés dans un concentrateur sous vide speedvac et stockés à -20 ° C jusqu'à l'analyse.

Pour l'identification et la quantification des peptides singulet modifiés par l'oxygène, les échantillons ont été redissous dans de l'acide formique à 0,1 % et 1 μg de peptides ont été analysés avec un spectromètre de masse Orbitrap Fusion Lumos Tribrid équipé d'une source nano-ESI avec le logiciel Tune et Xcalibur 4.3 fourni par le fournisseur. Les échantillons ont été séparés sur une colonne capillaire interne de 75 μm × 15 cm avec 3 μm de matériau C18 (ReproSil-pur, #r13.b9.) et connectée à un système UHPLC EASY-nLC 1200 (Thermo). Les peptides ont été séparés par chromatographie par un gradient linéaire de 95 min de 8 à 50 % de solvant B (A = 0,1 % d'acide formique dans l'eau, B = 0,1 % d'acide formique dans 80 % d'acétonitrile) et suivi d'une augmentation linéaire à 98 % de B en 6 min à un débit de 300 nL/min. L'Orbitrap Fusion Lumos a acquis des données d'une manière dépendante des données en alternant entre des scans MS et MS2 à balayage complet. La tension de pulvérisation a été fixée à 2,1 kV et la température du capillaire de transfert d'ions était de 320 °C. Les spectres MS (350 - 2000 m/z) ont été collectés avec une résolution de 120 000, un AGC de 4 × 105 et un temps d'injection maximal de 150 ms. Les dix précurseurs multichargés les plus abondants de chaque analyse complète ont été fragmentés par HCD avec une énergie de collision normalisée de 30 %, des fenêtres d'isolement quadripolaires de 1,6 m/z et un réglage de résolution de 30 000. Des cibles AGC pour un spectre de masse en tandem de 5 × 104 et un temps d'injection maximal de 150 ms ont été utilisées. L'exclusion dynamique a été fixée à 30 s. Les ions non attribués ou ceux avec une charge de 1+ et >7+ ont été rejetés pour MS/MS.

Les données brutes ont été traitées à l'aide de la plateforme de calcul FragPipe basée sur MSFragger32. Un algorithme de recherche ouverte avec une tolérance de masse des précurseurs -150 à 500 Da a été utilisé pour déterminer le déplacement de masse et les acides aminés correspondants. Ensuite, des modifications sur l'histidine avec une masse delta +229,0964 et +247,1069 Da ont été utilisées dans PD (protéome découvreur 2.5, Thermo) pour identifier les peptides modifiés.

Les cellules exprimant de manière stable les gènes de fusion miniSOG ont été ensemencées dans une boîte de 6 cm. Lorsqu'elles ont atteint une confluence d'environ 80 %, les cellules ont été lavées une fois avec du HBSS (Gibco, #14025092), suivies d'une incubation avec des sondes chimiques dans du HBSS à 37 °C pendant 1 h et d'un éclairage avec une LED bleue de 10 W pendant 20 min à température ambiante. Pour déterminer quel type d'espèce réactive de l'oxygène est impliqué dans le PDPL, 0,5 mM de vitamine C (MCE, #HY-B0166), 5 mM de Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0), 100 mM de mannitol (Energy Chemical, #69-65-8), 100 μM H2O2, 10 mM NaN3 ont été ajoutés aux cellules en tant qu'additifs. Après rinçage avec du PBS froid, les cellules ont été grattées, collectées dans un tube à centrifuger de 1,5 ml et lysées dans 200 μL de PBS avec 1x inhibiteur de protéase sans EDTA en utilisant la sonication de la pointe pendant 1 min (1 s allumée et 1 s éteinte, amplitude de 35%). Le mélange résultant a été centrifugé à 15 871 × g pendant 10 min à 4 °C et la concentration du surnageant a été ajustée à 1 mg/mL à l'aide d'un kit de dosage de protéines BCA. Environ 50 μL du lysat ci-dessus ont été incubés avec 0, 1 mM de rhodamine-azide (Aladdin, # T131368), 1 mM de TCEP, 0, 1 mM de ligand TBTA et 1 mM de CuSO4 pendant 1 h avec une rotation ascendante à température ambiante. Après la réaction de clic, une précipitation à l'acétone a été effectuée en ajoutant 250 μL d'acétone pré-refroidie à l'échantillon, une incubation à -20 ° C pendant 20 min et une centrifugation à 6010 × g pendant 10 min à 4 ° C. Le culot a été récupéré et bouilli dans 50 μL de tampon Laemmli 1x pendant 10 min à 95 °C. Les échantillons ont ensuite été analysés dans un gel long SDS-PAGE, visualisés par le système d'imagerie Bio-rad ChemiDoc MP Touch avec le logiciel Image Lab Touch.

L'expression et la purification de la protéine recombinante miniSOG-6xHis ont été réalisées comme décrit précédemment18. En bref, des cellules Escherichia coli BL21(DE3) (TransGen, #CD701-02) ont été transformées avec pET21a-miniSOG-6xHis et ont induit l'expression de la protéine par 0,5 mM d'IPTG (Sangon, #A600168). Après la lyse cellulaire, la protéine a été purifiée via des billes d'agarose Ni-NTA (MCE, #70666), dialysée contre du PBS et stockée à - 80 °C.

Pour le test de marquage de proximité à base d'anticorps in vitro, 100 μM de miniSOG purifié, 1 mM de sonde 3 et 1 μg d'anticorps monoclonal de souris anti-his-tag (TransGen, # HT501-01) ont été mélangés dans du PBS avec 50 μL de volume réactionnel total. Le mélange réactionnel a été irradié avec une lumière LED bleue pendant 0, 2, 5, 10 et 20 min à température ambiante. Le mélange a été incubé avec 0, 1 mM de biotine-PEG3-azide (Aladdin, # B122225), 1 mM de TCEP, 0, 1 mM de ligand TBTA et 1 mM de CuSO4 sur un agitateur ascendant à température ambiante pendant 1 h. Après la réaction de clic, un tampon Laemmli 4x a été ajouté directement au mélange et bouilli pendant 10 min à 95 ° C. Les échantillons ont été passés sur gel SDS-PAGE et analysés par Western blot à la streptavidine-HRP (1:1000, Solarbio, #SE068).

Pour le dosage de marquage de proximité à base de peptides in vitro, un peptide synthétique contenant de l'histidine (LHDALDAK-CONH2) avec amidation C-terminale a été utilisé. Dans cet essai, 100 μM de miniSOG purifié, 10 mM de sonde 3 et 2 μg/mL de peptide synthétique ont été mélangés dans du PBS avec un volume de réaction total de 50 μL. Le mélange réactionnel a été irradié avec une lumière LED bleue pendant 1 h à température ambiante. Un échantillon de microlitre a été analysé par le système LC-MS (Waters, spectromètre de masse à temps de vol de mobilité des ions SYNAPT XS avec logiciel d'analyse MassLynx Spectrum).

Les cellules HEK293T exprimant de manière stable les gènes de fusion miniSOG ont été ensemencées dans des boîtes de 10 cm pour différentes lignées de localisation d'organites (Mito, ER, Nucleus) et dans des boîtes de 15 cm pour les lignées Parkin-miniSOG et BRD4-miniSOG. Lorsqu'elles ont atteint une confluence d'environ 90 %, les cellules ont été lavées une fois avec du HBSS, suivies d'une incubation avec la sonde 3 dans du HBSS à 37 °C pendant 1 h et d'un éclairage avec une LED bleue de 10 W comme indiqué à température ambiante. Pour le marquage de proximité Parkin, 10 μM de protonophore carbonyl cyanure m-chlorophényl hydrazone CCCP (Solarbio, # C6700) ont été ajoutés avec la sonde 3 dans du HBSS à 37 ° C pendant 1 h. Les étapes de lyse cellulaire, de chimie du clic, de réduction et d'alkylation étaient les mêmes que ci-dessus, sauf que 2 mg de lysat ont été introduits et que la biotine-PEG3-azide au lieu de la biotine-azide photo-clivable a été utilisée dans la réaction de clic. Après enrichissement des billes, les billes ont été lavées trois fois avec 5 ml de PBS contenant 0,2 % de SDS, 5 ml de PBS contenant 1 M d'urée trois fois et 5 ml de PBS trois fois. Après cela, 2 µg de trypsine dans 300 µL d'ABC 25 mM contenant de l'urée 1 M ont été ajoutés pour la digestion des protéines pendant une nuit à 37 °C. La réaction a été désactivée en ajoutant de l'acide formique jusqu'à ce que le pH atteigne 2-3. Après digestion à la trypsine sur billes, la solution de peptide a été dessalée à l'aide de la colonne SOLAµ HRP (Thermo, #60209-001) et séchée dans un concentrateur sous vide speedvac. Les peptides ont été redissous dans de l'acide formique à 0,1 % et 500 ng de peptides ont été analysés avec un spectromètre de masse Orbitrap Fusion Lumos Tribrid équipé d'une source nano-ESI comme décrit ci-dessus. Les peptides ont été séparés sur une pré-colonne commerciale RP-HPLC (75 μm × 2 cm) (Thermo, #164946) et une colonne analytique RP-HPLC (75 μm × 25 cm) (Thermo, #164941), toutes deux remplies de billes C18 de 2 μm en utilisant un gradient linéaire allant de 8 à 35 % d'ACN en 60 min et suivi d'une augmentation linéaire à 98 % de B en 6 min à un débit de 300 nL/min. Les spectres MS (350 - 1500 m/z) ont été collectés avec une résolution de 60 000, un AGC de 4 × 105 et un temps d'injection maximal de 50 ms. Les ions sélectionnés ont été séquentiellement fragmentés dans un cycle de 3 s par HCD avec une énergie de collision normalisée de 30 %, des fenêtres d'isolement quadripolaires de 1,6 m/z et une résolution de 15 000. Des cibles AGC pour un spectre de masse en tandem de 5 × 104 et un temps d'injection maximal de 22 ms ont été utilisées. L'exclusion dynamique a été fixée à 45 s. Les ions non attribués ou ceux avec une charge de 1+ et >7+ ont été rejetés pour MS/MS.

Les étapes de préparation des échantillons jusqu'à l'enrichissement des billes NeutrAvidin étaient les mêmes que dans l'analyse LC-MS/MS mentionnée ci-dessus. Environ 50 µg de lysat ont été utilisés comme entrée de contrôle de chargement et 2 mg de lysat ont été utilisés pour la réaction de clic. Après enrichissement et lavage en NeutrAvidin, les protéines de liaison ont été éluées en ajoutant 50 µL de tampon Laemmli aux billes de résine d'agarose et en faisant bouillir pendant 5 min à 95 °C. L'entrée de contrôle de chargement et les échantillons enrichis en billes ont été analysés par SDS-PAGE et transférés sur des membranes PVDF (Millipore, #ISEQ00010) par des méthodes de transfert Western standard. Les membranes ont été bloquées dans du lait écrémé à 5 % (Sangon, #A600669) dans du TBS contenant 0,1 % de tween-20 (TBST) et incubées séquentiellement avec des anticorps primaires et secondaires. L'anticorps primaire a été utilisé à une dilution de 1:1000 dans du lait écrémé à 5 % dans du TBST et incubé pendant une nuit à 4 °C. Les anticorps secondaires ont été utilisés à 1:5000 et incubés pendant 1 h à température ambiante. Les membranes ont été visualisées par chimiluminescence par le système d'imagerie Chemidoc MP. Les analyses non recadrées de tous les transferts et gels des figures sont fournies en tant que données sources.

Les anticorps primaires utilisés dans cette étude comprennent l'anticorps monoclonal de lapin anti-SFPQ (CST, #71992), l'anticorps monoclonal de lapin anti-FUS (CST, #67840), l'anticorps polyclonal de lapin anti-NSUN2 (Proteintech, #20854-1-AP), l'anticorps polyclonal de lapin anti-mSin3A (Abcam, #ab3479), l'anticorps monoclonal de souris anti-Flag tag (TransGen, #HT201-02), -anticorps monoclonal de souris -β-actine (TransGen, #HC201-01), anticorps monoclonal de lapin anti-CDK2 (ABclonal, #A0094), anticorps monoclonal de lapin anti-CTBP1 (ABclonal, #A11600), anticorps polyclonal de lapin anti-DUT (ABclonal, #A2901), anticorps polyclonal de lapin anti-PSMC4 (ABclonal, #A2505), polyclonal de lapin anti-DNAJB1 anticorps (ABclonal, #A5504). Ces anticorps ont été utilisés à une dilution de 1:1000 dans du lait écrémé à 5 % dans du TBST. Les anticorps secondaires utilisés dans cette étude comprennent les IgG anti-lapin (TransGen, #HS101-01), les IgG anti-souris (TransGen, #HS201-01) à une dilution de 1:5000.

Pour examiner plus en détail si BRD4 interagit avec SFPQ, des cellules stables HEK293T et HEK293T et BRD4-miniSOG surexprimant HEK293T ont été ensemencées dans des boîtes de 10 cm. Les cellules ont été lavées avec du PBS froid et lysées dans 1 ml de tampon de lyse Pierce IP (Thermo Fisher, # 87787) avec 1x inhibiteur de protéase sans EDTA pendant 30 min à 4 ° C. Ensuite, les lysats ont été collectés dans un tube à centrifuger de 1,5 ml et centrifugés à 15 871 × g pendant 10 min à 4 ° C. Les surnageants ont été collectés et incubés avec 5 µg d'anticorps monoclonal de souris anti-étiquette V5 (CST, #80076) pendant une nuit à 4 °C. Environ 50 µL de billes magnétiques de protéine A/G (MCE, #HY-K0202) ont été lavées deux fois avec du PBS contenant 0,5 % de tween-20. Le lysat cellulaire a ensuite été incubé avec les billes magnétiques avec une rotation de bas en haut pendant 4 h à 4 ° C. Ensuite, les billes ont été lavées quatre fois avec 1 ml de tampon PBST et bouillies pendant 5 min à 95 ° C. Les échantillons ont été analysés dans un gel SDS-PAGE et transférés sur des membranes PVDF par des méthodes de transfert Western standard. Les membranes ont été bloquées dans du lait écrémé à 5 % dans du TBST et incubées séquentiellement avec des anticorps primaires et secondaires. L'anticorps monoclonal de lapin anti-SFPQ primaire (CST, # 71992) a été utilisé à une dilution de 1: 1000 dans du lait écrémé à 5% dans du TBST et incubé pendant une nuit à 4 ° C. IgG anti-lapin a été utilisé à 1:5000 et incubé pendant 1 h à température ambiante. Les membranes ont été visualisées par chimiluminescence par le système d'imagerie Chemidoc MP.

Toutes les structures utilisées pour l'analyse de la surface accessible aux solvants (SASA) ont été obtenues à partir de la Protein Data Bank (PDB)52 ou de l'AlphaFold Protein Structure Database53. Le SASA absolu de chaque résidu a été calculé à l'aide du programme FreeSASA54. Seules les données SASA des histidines marquées et de leurs voisins qui étaient complètes et non ambiguës ont été utilisées pour obtenir la SASA moyenne pour chaque structure. L'accessibilité relative aux solvants (RSA) pour chaque histidine a été calculée en divisant les valeurs absolues de SASA par la surface empirique maximale possible accessible aux solvants du résidu55. Ensuite, toutes les histidines ont été classées comme enfouies si le RSA moyen était inférieur à 20 % et exposées dans le cas contraire56.

Les fichiers bruts acquis en mode DDA ont été recherchés dans les bases de données de protéines correspondantes révisées par SwissProt contenant des contaminants courants à l'aide de Proteome Discoverer (v2.5) ou MSfragger (Fragpipe v15.0). Les peptides devaient être entièrement trypsiques avec un maximum de deux sites de clivage manqués, la carbamidométhylation comme modification fixe et l'oxydation de la méthionine comme modification dynamique. La tolérance de masse du précurseur et du fragment a été fixée à 10 ppm et 0,02 Da (MS2 orbitrap), respectivement. Les occurrences de contaminants ont été supprimées et les protéines ont été filtrées pour obtenir un taux de fausses découvertes de <1 %. Les abondances de protéines normalisées de trois répétitions biologiques ont été utilisées pour une analyse de quantification sans étiquette. L'analyse de la localisation subcellulaire des protéines a été activée par l'analyse Gene Ontology (GO) de DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0, et une base de données collectée et publiée par le groupe Alice Ting8. Les parcelles de volcan ont été acquises auprès de Perseus (v1.6.15.0). Les changements de pli de l'abondance des protéines ont été testés pour leur signification statistique à l'aide d'un test t bilatéral, et les résultats protéiques ont été identifiés avec un changement d'abondance> 2 (sauf indication contraire) et une valeur p <0, 05. L'analyse des interactions protéiques a été réalisée à l'aide de l'analyse GO ainsi que de la base de données String.

Trois répétitions biologiques ont été réalisées avec des résultats similaires. L'analyse statistique a été effectuée sur GraphPad Prism (logiciel GraphPad) et les parcelles de volcan ont été acquises auprès de Perseus (v1.6.15.0). Pour la comparaison entre les deux groupes, les valeurs p ont été déterminées à l'aide d'un test t de Student bilatéral. Les protéines singleton qui n'ont été identifiées que dans les groupes expérimentaux au moins deux fois, ont été incluses dans les parcelles de volcan, et les valeurs manquantes correspondantes dans les groupes témoins ont été remplacées de la distribution normale par Perseus pour permettre le calcul de la valeur p. Les barres d'erreur représentent les moyennes ± SD. Dans l'analyse protéomique, les abondances de protéines qui apparaissent dans au moins deux répétitions biologiques ont été conservées pour permettre l'analyse statistique. Aucune méthode statistique n'a été utilisée pour prédéterminer la taille de l'échantillon. Les expériences n'étaient pas randomisées. Les enquêteurs n'ont pas été aveuglés à l'allocation pendant les expériences et l'évaluation des résultats.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Les données de spectrométrie de masse générées dans cette étude ont été déposées auprès du consortium ProteomeXchange via le référentiel partenaire iProX57 avec l'identifiant de jeu de données PXD034811 (jeu de données PDPL-MS). Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source. Les données sources sont fournies avec ce document.

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Nous remercions l'installation centrale de spectrométrie de masse, l'installation centrale d'imagerie et l'installation centrale de séquençage du laboratoire de la baie de Shenzhen pour leur aide dans l'analyse des échantillons. Nous remercions le Dr Yu-Hsan Tsai, le Dr Xiaoyu Li et le Dr Jeff Montgomery pour leurs discussions utiles et leur aide à la relecture. Nous sommes reconnaissants pour le soutien financier de ce travail de la part des personnes suivantes : subvention de la National Natural Science Foundation (32101200 à GL), subvention du Guangdong-Shenzhen Regional Joint Fund (2020A1515110903 à GL) et subvention du Shenzhen Bay Laboratory Open Fund (SZBL2020090501008 à GL).

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Yansheng Zhai, Xiaoyan Huang.

Institut de biologie des systèmes et physique, Laboratoire de la baie de Shenzhen, Shenzhen, 518132, Chine

Yansheng Zhai, Xiaoyan Huang, Keren Zhang, Yuchen Huang, Jingwei Cui, Zhe Zhang, Weiye Zhong et Gang Li

Département de chimie, UF Scripps Biomedical Research, 130 Scripps Way, Jupiter, FL, 33458, États-Unis

Yanlong Jiang

École des sciences de la vie, Université des sciences et technologies de Chine, Hefei, Anhui, 230026, Chine

Zhe Zhang

Multi-omics Mass Spectrometry Core, Office of Core Facility, Shenzhen Bay Laboratory, Shenzhen, 518132, Chine

Cookson KC Chiu

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Tous les auteurs ont examiné le manuscrit. GL a conçu l'étude et supervisé la recherche. YZ, XH, KZ, YH et GL ont conçu et analysé des expériences. YZ, XH, KZ, YH, JC, WZ et CKCC ont réalisé des expériences. YJ a proposé le mécanisme chimique. ZZ a effectué l'analyse SASA. YZ et GL ont rédigé le manuscrit.

Correspondance à Gang Li.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Des rapports d'examen par les pairs sont disponibles.

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Réimpressions et autorisations

Zhai, Y., Huang, X., Zhang, K. et al. Profilage de réseaux de protéines à résolution spatio-temporelle avec marquage de proximité dépendant de la photoactivation. Nat Commun 13, 4906 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32689-z

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Reçu : 23 mars 2022

Accepté : 11 août 2022

Publié: 20 août 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-022-32689-z

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