Aperçus structurels et mécanistes de la β fongique

Nature volume 616, pages 190–198 (2023)Citer cet article

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La synthase intégrée à la membrane FKS est impliquée dans la biosynthèse du β-1,3-glucane, le composant central de la paroi cellulaire fongique1,2. Le FKS est la cible de médicaments antifongiques largement prescrits, notamment l'échinocandine et l'ibrexafungerp3,4. Malheureusement, le mécanisme d'action du FKS reste énigmatique et cela a entravé le développement de médicaments plus efficaces ciblant l'enzyme. Nous présentons ici les structures de cryo-microscopie électronique de Saccharomyces cerevisiae FKS1 et du mutant résistant à l'échinocandine FKS1(S643P). Ces structures révèlent le site actif de l'enzyme à l'interface membrane-cytoplasme et une voie de translocation du glucane traversant la bicouche membranaire. De multiples lipides liés et des distorsions membranaires notables sont observés dans les structures FKS1, suggérant des interactions actives FKS1-membrane. Les mutations résistantes à l'échinocandine sont regroupées dans une région proche de TM5–6 et TM8 de FKS1. La structure de FKS1(S643P) révèle des arrangements lipidiques modifiés dans cette région, suggérant un mécanisme résistant aux médicaments de l'enzyme mutante. Les structures, le mécanisme catalytique et les connaissances moléculaires sur les mutations résistantes aux médicaments de FKS1 révélées dans cette étude font progresser la compréhension mécaniste de la biosynthèse fongique des β-1,3-glucanes et établissent une base pour le développement de nouveaux médicaments antifongiques en ciblant FKS.

Les infections fongiques invasives causent plus de 1,5 million de décès par an, ce qui constitue une grave menace pour la santé publique5. Ces infections sont très préoccupantes (par exemple, entraînant une mortalité élevée) pour les populations immunodéprimées ainsi que pour les patients atteints de COVID-19 (réfs. 5,6) (https://www.cdc.gov/fungal/covid-fungal.html ). Des classes limitées de médicaments antifongiques et des souches émergentes résistantes aux médicaments telles que la récente épidémie de Candida auris multirésistant ont posé de sérieux défis dans le traitement des patients infectés7,8. Par conséquent, il existe des besoins pressants pour développer de nouveaux agents antifongiques8.

Le β-1,3-glucane est un composant fondamental de la paroi cellulaire fongique2, donc cibler sa biosynthèse est une stratégie importante pour développer des médicaments antifongiques à large spectre3,9. Le β-1,3-glucane de la paroi cellulaire fongique est synthétisé par la synthase intégrée à la membrane FKS10,11, qui est régulée par la GTPase Rho1 (réf. 12,13). FKS transfère le glucose de l'UDP-glucose donneur à la chaîne en croissance de glucane via des liaisons β-1,3-glycosidiques et transloque le β-1,3-glucane polymérisé dans l'espace extracellulaire (Fig. 1a). Les orthologues de FKS ont été identifiés dans tous les champignons analysés et sont essentiels à la viabilité de nombreux pathogènes fongiques importants. Chez Candida glabrata et S. cerevisiae, la perturbation simultanée de FKS1 et FKS2 a montré un phénotype létal14,15 ; FKS1 de Candida albicans et Cryptococcus neoformans sont essentiels à la viabilité16,17 ; la moisissure Aspergillus fumigatus avec une délétion FKS1 souffre de graves défauts de croissance et de lyse cellulaire18. Actuellement, il existe sur le marché deux médicaments antifongiques bien connus qui ciblent le FKS : l'échinocandine, le médicament antifongique de première ligne largement utilisé en pratique clinique19, et l'ibrexafungerp, un médicament fongicide oral nouvellement approuvé4. D'autres nouveaux agents ciblant la fonction FKS (par exemple, la rezafungine) entrent dans des essais cliniques de stade avancé4. Malheureusement, les mutations FKS sont étroitement liées à la résistance aux échinocandines et à l'échec thérapeutique, une préoccupation émergente dans les infections fongiques invasives20,21. De nombreuses mutations résistantes aux échinocandines identifiées cliniquement sont concentrées dans trois régions conservées de FKS20,22. Des mutations dans un seul allèle FKS sont suffisantes pour rendre les souches fongiques résistantes à l'échinocandine23.

a, modèle de la paroi cellulaire fongique. FKS1 utilise UDP-Glc pour synthétiser le β-1,3-glucane. Le graphique du panneau a a été créé à l'aide de BioRender (https://biorender.com). b, Dosage in vivo de FKS1 en examinant la croissance de la souche WT et de la souche FKS1-KO (KO) avec ou sans l'inhibiteur de FKS2 FK506. Les données sont moyennes ± sem ; n = 3 expériences indépendantes. c, Activité in vitro de FKS1 purifiée par CHAPS avec différents effecteurs : UDP-Glc, Rho1, GTPγS et des médicaments antifongiques (caspofungine (CFN) et micafungine (MCF)). L'activité a été mesurée en surveillant l'UDP généré. Les données sont moyennes ± sem ; n = 3 expériences indépendantes. d, e, Digestion enzymatique du polymère insoluble dans l'eau synthétisé par FKS1 (S643P) purifié par GDN. Des endo-1,3-β-glucanase et endo-1,4-β-glucanase spécifiques ont été utilisées. Ces expériences ont été répétées trois fois avec des résultats similaires. Une image représentative de la digestion du polymère (d) et des échantillons d'hydrolyse en d retirés aux moments indiqués et soumis à une analyse par chromatographie en couche mince (e) est présentée. Le glucose (G1), le laminaribiose (G2), le laminaritriose (G3) et le laminarihexaose (G6) ont été utilisés comme étalons (piste M). f, analyse de la liaison glycosyle (méthylation) du polymère synthétisé par FKS1 (S643P) purifié par GDN. Un profil de chromatogramme en phase gazeuse des acétates d'alditol partiellement méthylés dérivés des polymères synthétisés est présenté. Le pic dominant (souligné par une boîte verte en pointillés) représente la liaison 1,3-Glcp, confirmée par spectrométrie de masse (Extended Data Fig. 2d). g, Schéma de l'organisation du domaine de FKS1. h, carte Cryo-EM de FKS1, vue parallèle à la membrane. La carte est segmentée en quatre parties colorées en g avec des densités de type lipidique en jaune clair. i, Deux vues orthogonales de la structure FKS1 en dessin animé. Quatre parties de FKS1 sont colorées comme dans g. j, Vue intracellulaire de la région cytoplasmique avec le domaine TM caché. La feuille β centrale du domaine FKS1 GT est composée de β3 – β11 comme indiqué. Les lignes pointillées indiquent les régions désordonnées.

L'absence d'une structure FKS a entravé notre compréhension du mécanisme catalytique de FKS et entravé le développement de nouveaux médicaments antifongiques. FKS est une protéine intégrée à la membrane d'environ 200 kDa avec de faibles homologies de séquence avec d'autres glycosyltransférases (GT) caractérisées. FKS appartient à la famille GT48 sans structures disponibles pour aucun de ses membres. Nous rapportons ici les structures de cryo-microscopie électronique (cryo-EM) de S. cerevisiae FKS1 et de son mutant résistant aux médicaments FKS1(S643P). D'autres caractérisations fonctionnelles guidées par la structure nous permettent d'élucider la base moléculaire de la biosynthèse du β-1,3-glucane par FKS1 et de rationaliser les mutations résistantes aux médicaments de l'enzyme.

Pour les études fonctionnelles in vivo, nous avons combiné la suppression génétique de FKS1 avec la manipulation pharmacologique de FKS2 pour contourner le phénotype létal causé par la perturbation simultanée de FKS1 et FKS2 chez S. cerevisiae15. La souche de type sauvage (WT) a montré une croissance légèrement ralentie avec l'inhibiteur spécifique de FKS2 FK506 (réf. 15, 24) (Fig. 1b). En revanche, la souche FKS1-knockout (KO) a présenté une croissance significativement réduite sans FK506 et une inhibition de croissance presque totale avec FK506.

Ensuite, nous avons immunopurifié le FKS1 de S. cerevisiae exprimé de manière endogène dans le détergent CHAPS, qui est fréquemment utilisé pour le test d'activité de FKS113,25 (voir Méthodes). Traditionnellement, l'activité FKS est mesurée par une méthode radioactive sur membrane brute ou FKS13, 25, 26 piégée par le produit, et ici nous avons constaté que la surveillance de l'UDP générée peut constituer un système pratique sans radiomarqueur pour le dosage de l'activité FKS1. FKS1 seul n'a pas montré d'activité apparente. L'ajout de Rho1 purifié sous la forme chargée de GTPγS a considérablement stimulé l'activité de FKS1 (Fig. 1c), confirmant le rôle régulateur essentiel de Rho1 sur FKS1 (réfs. 12, 13). L'activité spécifique de WT FKS1 a été déterminée à environ 824 nmol min-1 mg-1, ce qui est comparable aux études précédentes10,25,27. Plus important encore, l'ajout de caspofungine ou de micafungine, deux médicaments antifongiques largement utilisés qui peuvent inhiber la synthèse de β-1,3-glucane19, a considérablement réduit l'activité de FKS1.

Pour confirmer davantage le rôle de FKS1 dans la synthèse de β-1,3-glucane, nous avons analysé le produit formé par FKS1 purifié. À cette fin, nous avons testé WT FKS1 et le variant FKS1(S643P), qui est l'une des mutations résistantes aux échinocandines les plus fréquemment observées28. Nous avons émis l'hypothèse que cette dernière variante pourrait modifier le comportement de la synthase. Une fois purifiés jusqu'à homogénéité dans le détergent GDN (données étendues Fig. 1a – d et Fig. 1 supplémentaire), WT FKS1 et FKS1 (S643P) ont présenté une activité, qui peut être épuisée par immunodéplétion (données étendues Fig. 1h – j). Nous avons constaté que le FKS1 purifié par GDN peut être activé par la caspofungine. La caspofungine peut stimuler l'activité de FKS1 (S643P) (Extended Data Fig. 1h – j). Ceci est en outre confirmé par la synthèse de produits à grande échelle dans laquelle seul le FKS1 (S643P) avec la caspofungine a produit une quantité significative de polymère insoluble dans l'eau (Extended Data Fig. 1k). Le fait que l'enzyme purifiée dans GDN et dans CHAPS se comporte très différemment (Extended Data Fig. 1i versus Fig. 1c) suggère que la fonction FKS1 peut être sensible aux environnements membranaires. La synthèse du produit par FKS1 (S643P) présente une spécificité de donneur vis-à-vis du ligand préféré UDP-Glc par rapport à UDP-GlcNAc (Extended Data Fig. 1l). De plus, l'EDTA peut soutenir l'activité catalytique de l'enzyme et le Mg2+ a significativement inhibé l'activité (Extended Data Fig. 1m), conformément aux études précédentes25,29,30. Introduction d'une mutation K1261A, une mutation d'inactivation enzymatique découverte à partir de notre analyse structurale (voir la section 'Le site actif et le mécanisme catalytique'), à FKS1(S643P) a complètement inactivé l'activité de synthèse de produit de l'enzyme hyperactive (Extended Data Fig. 1h -k). Les tests ci-dessus illustrent l'activité enzymatique spécifique de FKS1.

Pour confirmer la formation de la liaison β-1,3-glycosidique, nous avons effectué un test d'hydrolyse sur le polymère synthétisé par FKS1 (S643P). En conséquence, l'endo-1,3-β-glucanase peut complètement hydrolyser le polymère, contrairement à l'endo-1,4-β-glucanase (Fig. 1d et Extended Data Fig. 2a). L'analyse par chromatographie en couche mince a montré que l'hydrolysat catalysé par l'endo-1,3-β-glucanase de notre polymère synthétisé correspond au modèle d'hydrolysat de curdlan (la norme β-1,3-glucane) (Fig. 1e et Extended Data Fig. 2b,c). De plus, l'analyse de la liaison glycosyle par méthylation a montré que le 1,3-Glcp est la liaison dominante dans le polymère synthétisé (Fig. 1f et Extended Data Fig. 2d). En résumé, les études biochimiques et chimiques ci-dessus établissent fermement que FKS1 est une β-1,3-glucane synthase.

Pour mieux comprendre le mécanisme de FKS1, nous avons déterminé la structure cryo-EM de FKS1 purifié par GDN à une résolution globale de 3, 4 Å (Fig. 1g, h, tableau de données étendu 1 et données étendues Fig. 3). La carte de densité a permis la construction de novo d'un modèle atomique de FKS1 avec la plupart des résidus résolus (Extended Data Fig. 4). A notre connaissance, il représente la première structure des GT à membrane de la famille GT48.

La structure globale de FKS1 mesure environ 100 Å × 115 Å × 100 Å (Fig. 1i). Il contient un domaine transmembranaire (TM) avec 17 hélices TM (TM1–17) et une entité cytoplasmique volumineuse. Le domaine TM adopte une forme en forme de coin, avec son extrémité la plus étroite (environ 35 Å) du côté extracellulaire. FKS1 n'a pas de domaines structurés extracellulaires apparents et plusieurs boucles allongées relient les hélices TM. Il existe plusieurs régions non structurées, détaillées dans la section Méthodes "Construction et raffinement du modèle".

La partie cytoplasmique de FKS1 contient un domaine N-terminal et un domaine intermédiaire, séparés par TM1–6 dans la séquence primaire (Fig. 1g). Le domaine intermédiaire (résidus 712–1266) adopte un pli GT-A caractéristique des GT : un feuillet β central continu de neuf brins (β3–β11) entouré de plusieurs hélices α31 (Fig. 1j et Extended Data Fig. 3h) . Il est donc nommé domaine GT. Le domaine N-terminal (résidus 146–442) contient 14 hélices α (l'hélice 6–7 n'est pas modélisée en raison du manque de densités) (Extended Data Fig. 3i). Une recherche avec le serveur Dali n'a pas réussi à récupérer des structures similaires à ce domaine. Ainsi, nous l'avons nommé domaine accessoire (AC). Le domaine AC interagit largement avec le domaine GT, enfouissant une surface d'interface totale de 2 504 Å2. Trois boucles du domaine GT (boucle reliant β5 et β6 (Lβ5 – β6), Lβ7 – β8 et Lβ8 – β9) fonctionnent comme des mâchoires de pince pour serrer le domaine AC (Fig. 1j). Le R319 hautement conservé du domaine AC interagit avec N1087 du domaine GT dans l'interface de domaine (Extended Data Fig. 3j). Il a déjà été démontré que la substitution R319A réduisait de manière significative la fonction de FKS124, indiquant que les deux domaines cytoplasmiques fonctionnent ensemble comme une unité structurelle compacte.

Sur les 17 hélices TM au total dans FKS1, TM1–8 fournit l'essentiel de l'interface d'interaction avec l'entité cytoplasmique (Fig. 2a, b et Extended Data Fig. 3i). TM1–4 forment un faisceau d'hélices étroitement tassées, en contact avec TM5–7 d'un côté (Fig. 2c). TM5–17 sont tous inclinés comme des pétales de fleurs ouverts lorsqu'ils sont vus du côté cytosolique (Fig. 2a, c). Entre le TM5–17 incliné et le domaine GT se trouve une grande chambre exposée au solvant, qui fait partie du site actif de l'enzyme (voir ci-dessous). Le domaine TM comporte deux poches intégrées à la membrane (Fig. 2a). La poche du côté extracellulaire est formée parce que les TM9–10 et TM12 exposés à la membrane sont nettement plus courts que les hélices TM typiques. L'autre poche du côté cytosolique est formée en raison de l'inclinaison des hélices TM. Ces deux poches forment probablement ensemble une voie de translocation des glucanes (voir ci-dessous). De plus, cinq longues boucles extracellulaires (EL1–5) s'entrelacent pour stabiliser les extrémités extracellulaires proches de TM5–17. Deux liaisons disulfure conservées (C658 – C669 sur EL1 et C1328 – C1345 sur EL2) et un glycane potentiel lié à N sur le N1849 conservé se trouvent dans ces boucles (Fig. 2a, b). L'inclinaison de TM5–17 entraîne de grandes distances entre les hélices voisines à l'extrémité cytosolique (Fig. 2c). Les espaces étendus résultants créés sont remplis par trois hélices latérales (LH1–3) parallèles à la bicouche membranaire : LH1–2 comble le grand espace créé par deux feuilles à trois hélices (TM11, TM12 et TM16 ; et TM14, TM15 et TM17 ), tandis que LH3 remplit les extrémités de LH1–2.

a, Vue de face du FKS1. Dix-sept hélices TM (désignées par des chiffres) sont en représentation de dessin animé; les domaines cytoplasmiques AC et GT sont respectivement dans les rubans jaune et bleu. Les liaisons disulfure conservées à EL1–2 et le glycane N-lié sur N1849 conservé de EL5 sont marqués. Les lipides ordonnés sont en bâtonnets jaunes. Les trois ovales marquent les positions de trois poches impliquées dans la catalyse (une poche verte) et la translocation des glucanes (deux poches grises). b, Diagramme topologique du domaine FKS1 TM. Les lignes pointillées représentent les éléments flexibles invisibles dans la carte. c, Vue cytosolique des hélices FKS1 TM. L'encart montre la même vue que dans un avec la région cytosolique masquée. Les deux cercles de diamètres approximatifs mettent en évidence l'inclinaison de TM5–17, s'ouvrant vers le cytoplasme. d, les résidus (représentés sous forme de bâtonnets) interagissant avec le phospholipide interne (PL) sont délimités par la boîte pleine en a. e, vue de la membrane arrière de la région enrichie en lipides décrite par la boîte en pointillés en a. f–i, Comparaison des plis partagés putatifs entre FKS1 (famille GT48) (f) et trois synthases liées à la membrane de la famille GT2 : la cellulose synthase bactérienne BcsA (Protein Data Bank (PDB) ID : 4hg6) (g), la cellulose synthase végétale CesA (PDB ID : 6wlb) (h) et la hyaluronane synthase HAS (PDB ID : 7sp7) (i). Les structures superposées sont montrées séparément dans la représentation de bande dessinée. Leurs éléments correspondants sont dans le même schéma de couleurs, tandis que les éléments hors du pli partagé sont en surface grise ou en représentation de dessin animé comme indiqué. En f, les lignes pointillées indiquent des régions désordonnées. j–m, Comparaison des arrangements TM dans FKS1 (j), BcsA (k), CesA (l) et HAS (m). Les segments TM dans l'ombre grise appartiennent au pli partagé. Les hélices TM sont désignées par des nombres. L'astérisque marque le chemin de translocation du glucane proposé dans FKS1, BcsA, CesA et HAS.

La résolution de la carte FKS1 nous a permis d'identifier plusieurs lipides liés de manière ordonnée (Fig. 2a et Extended Data Fig. 4g, h). Un phospholipide au niveau du feuillet de la membrane cytosolique est contacté par TM11, TM15–16 et LH2 (Fig. 2d). Son groupe de tête est prêt à entrer en contact avec les résidus chargés R1455 (TM11) et R1684 (TM16). Ses deux queues lipidiques alkyles s'emballent avec des résidus hydrophobes environnants : H1654, I1655 et F1658 (TM15) ; I1680 (TM16); et V1745 et L1746 (LH2). Outre LH1–2, ce phospholipide semble également contribuer à la stabilisation de la disposition inclinée des hélices TM (Fig. 2a). D'autres densités de type lipidique ont été modélisées sous la forme de 24 chaînes alkyle lipidiques, principalement situées autour d'un noyau composé de TM5–13 (Fig. 2c). Parmi ceux-ci, sept lipides s'enroulent autour de TM5–6 (Fig. 2c) et 12 forment deux couches remplissant la surface concave créée par les hélices TM inclinées (Fig. 2e). Ces molécules lipidiques bien définies font probablement partie de la structure intégrale de FKS1.

Bien que l'architecture de FKS1 soit radicalement différente des GT membranaires avec des structures connues, nous avons remarqué qu'une partie de la structure de FKS1 (résidus 615-1510) ressemble aux topologies globales de deux cellulose synthases de la famille GT2 : les bactéries BcsA et ses homologue végétal CesA32,33 (Fig. 2f – h). Malgré leur faible identité de séquence (moins de 10 %), FKS1 et BcsA peuvent être superposés avec une valeur d'écart quadratique moyen de 4, 3 Å sur 308 résidus alignés (Extended Data Fig. 5a). Une recherche de structure homologue DALI a identifié deux structures supplémentaires ressemblant à cette topologie : la hyaluronane synthase (HAS) et la dolichylphosphate mannose transférase (PcManGT). De manière constante, HAS a été signalé avec une similitude structurelle globale avec BcsA34 (Fig. 2i, m); Il a été proposé que PcManGT contienne un pli minimal de type cellulose-synthase avec BcsA35. Celles-ci impliquent en outre que ces polysaccharides synthases liées à la membrane (FKS1, BcsA, CesA et HAS) peuvent partager un pli central, que nous appelons un pli de type cellulose-synthase. Ce pli partage plusieurs caractéristiques : il est composé de six hélices TM, le domaine GT séparant les deux hélices N-terminales des quatre hélices C-terminales (Fig. 2j – m) ; la limite membrane-cytosol contient plusieurs hélices d'interface amphipathiques (IF) (Fig. 2f – i); près de cette limite, l'hélice TM suivant le domaine GT (FKS1 TM7, BcsA TM5, CesA TM3 et HAS TM3) est allongée et a été proposée pour tapisser la voie de translocation des glucanes32,33,34.

Malgré la ressemblance globale de ce pli modulaire, des caractéristiques considérables spécifiques à FKS1 ont été révélées (Extended Data Fig. 5). Le domaine GT gagne des extensions considérables par rapport à BcsA (Extended Data Fig. 5a, b), et les hélices TM topologiquement correspondantes entre FKS1 et BcsA varient en orientation et en longueur (Extended Data Fig. 5c). Des variations plus notables se situent à l'interface membrane-cytoplasme. BcsA, CesA et HAS présentent trois IF amphipathiques similaires (IF1–3)33,34,36 (Fig. 2g–i). Dans FKS1, la contrepartie topologique de IF3 devient à la place des hélices TM (TM9–10) (Extended Data Fig. 5d, e). Bien que IF1–2 soient préservés dans FKS1, ils montrent des états distincts. IF1 (c'est-à-dire l'hélice α33 du domaine GT) de FKS1 tourne de près de 90 ° et est pris en sandwich entre TM6 et TM8 (Extended Data Fig. 5d). IF2 de BcsA correspond aux résidus 1247–1266 de FKS1, qui sont désordonnés sur la carte, bien que prédits comme une hélice (Extended Data Fig. 5c). Ce putatif FKS1 IF2 n'a pas le motif 'QxxRW' conservé parmi BcsA, CesA et HAS33,34,36 mais pourrait encore contribuer à la catalyse, comme nous le verrons plus tard.

Dans le pli de type cellulose-synthase, FKS1 contient une grande chambre exposée au solvant à l'interface membrane-cytoplasme (Fig. 3a). L'alignement de ce pli avec celui de BcsA révèle que la chambre de FKS1 chevauche bien le site actif de BcsA lié à l'UDP, indiquant fortement que la chambre est le site actif de FKS1 (Fig. 3b). Une recherche DALI a récupéré des structures homologues du domaine FKS1 GT (résidus 718 à 1239): PcManGT, BcsA, GalNAc-T7, TarP, CesA et HAS. Nous avons également analysé le modèle AlphaFold de la curdlan synthase car il synthétise le même polymère que FKS1 et présente une forte homologie (26% d'identités) avec BcsA37. Des comparaisons structurelles détaillées de ces cibles ont révélé que le site actif de FKS1 chevauche mieux les enzymes liées à la membrane telles que BcsA, CesA, curdlan synthase, HAS et PcManGT (Extended Data Fig. 6). Malgré la stéréochimie différente de leurs produits, la forte similitude structurelle de leurs sites actifs indique des mécanismes similaires dans la liaison au substrat et la catalyse de ces synthases, conformément aux études antérieures de BcsA, CesA et HAS33,34,36. Sur la base de ces informations, nous avons superposé les structures de FKS1 et BcsA pour révéler les résidus importants partagés sur le plan fonctionnel dans leurs sites actifs (Fig. 3c, d). Par exemple, deux paires de résidus (Y849 et E851, et K1082 et N1085 dans FKS1 ; Y149 et E151, et K226 et N229 dans BcsA) et le « motif ED » (E1221 et D1222 dans FKS1 ; et E342 et D343 dans BcsA) dans les deux enzymes peuvent être bien alignées. Ces résidus dans BcsA sont connus pour la liaison du donneur (Y149 et E151, et K226 et N229 dans BcsA) et pour le positionnement de la base catalytique générale aspartate (motif ED)36.

a, Une représentation de surface en coupe de FKS1 montrant le site actif à l'interface membrane-cytoplasme. Il relie une poche membranaire, qui a le potentiel de translocation de glucane. Des éléments structurels spécifiques sont représentés en dessin animé, colorés comme sur la figure 2a. Les hélices TM sont désignées par des nombres. Le motif ED hautement conservé (E1221 et D1222) situé sur l'hélice α35 fait face au site actif comme indiqué. b, domaines GT superposés des plis de type cellulose-synthase partagés entre BcsA lié à l'UDP (PDB ID : 4P00 ; en gris avec UDP dans le bâton magenta) et FKS1 (en orange). c, d, vue rapprochée des sites actifs entre BcsA (c) et FKS1 (d), comme indiqué par la boîte en pointillés en b. Les résidus impliqués dans la liaison au substrat ou la catalyse sont indiqués sous forme de bâtonnets. En c, UDP est représenté par le bâton magenta. En d, les résidus FKS1 conservés avec BcsA sont mis en évidence sous forme de bâtonnets jaunes. e, Essai fonctionnel in vivo des mutations du site actif dans FKS1. La croissance des souches indiquées pendant 72 h a été analysée sans (rang gauche) et avec (rang droit) l'inhibiteur spécifique de FKS2 FK506. Le test a été répété trois fois avec des résultats similaires. f, niveaux de glucane de la paroi cellulaire dans les souches portant les mutations FKS1 indiquées. g, Activités FKS1 in vitro de WT et de mutants de site actif purifiés avec CHAPS, avec ou sans l'inhibiteur de FKS1 CFN. Les activités ont été normalisées à la quantité de protéines. Pour f,g, les données sont moyennes ± sem ; n = 3 expériences indépendantes.

Ensuite, nous avons validé les rôles fonctionnels de ces résidus à l'aide de trois tests différents. Tout d'abord, nous avons introduit leurs mutations dans le locus chromosomique FKS1 et analysé le phénotype de croissance de chaque souche mutante en présence de FK506 (Fig. 3e). Les doubles mutations de Y849A; E851A et K1082A; N1085A et les mutations simples de E851A, K1082A et D1222A ont toutes empêché la croissance de la souche dans la mesure de la souche FKS1-KO (Fig. 3e). La mutation N1085A a ralenti la croissance et la mutation Y849A n'a pas eu d'effet évident sur la croissance. Deuxièmement, nous avons mesuré les niveaux de glucane de la paroi cellulaire dans ces souches lors de la croissance sans FK506. Nous avons constaté que toutes les mutations, y compris la souche FKS1-KO mais à l'exception de la substitution Y849A, diminuaient les niveaux globaux de glucane par rapport à la souche WT (Fig. 3f), correspondant bien à leurs phénotypes de croissance (Fig. 3e). Enfin, nous avons purifié chaque mutant FKS1 (à l'exception de FKS1 (D1222A)) et comparé leur activité catalytique in vitro (Fig. 3g et Extended Data Fig. 1g). Conformément aux phénotypes à base de cellules décrits ci-dessus, les mutations E851A, K1082A et N1085A ont significativement réduit l'activité enzymatique, tandis que la mutation Y849A n'a affecté que légèrement l'activité. Ensemble, les analyses in vivo et in vitro ci-dessus établissent fermement l'emplacement du site actif FKS1 ainsi que ses principaux résidus composants.

Une analyse structurale plus poussée nous a permis d'identifier des résidus supplémentaires critiques pour la catalyse FKS1. R382 et W383 dans le motif 'QxxRW' dans IF2 de BcsA sont connus pour être importants pour la liaison au substrat et la catalyse36. Bien que ce motif soit manquant dans FKS1, K1261 et F1258 sont situés aux positions correspondantes dans FKS1, comme le font R382 et W383 dans BcsA (Fig. 3c, d et Extended Data Fig. 5e). Dans plusieurs synthases liées à la membrane contenant le pli de type cellulose-synthase (BcsA, CesA et HAS), le résidu chargé positivement correspondant à BcsA R382 est impliqué dans la liaison du donneur, tandis que le résidu aromatique correspondant à BcsA W383 agit pour stabiliser l'accepteur33, 34,36 (Données étendues Fig. 6). En effet, F1258 et K1261 sont essentiels à la fonction de FKS1, comme le démontrent les analyses in vivo et in vitro de leurs mutations uniques d'alanine (Fig. 3e – g). Les analyses ci-dessus suggèrent en outre que les mécanismes catalytiques de base entre FKS1 et BcsA sont conservés.

FKS1 et BcsA sont toutes deux des polysaccharides synthases processives et leur produit polymérisé, les glucanes, doit être transloqué à travers les membranes1,38. Conformément à cela, juste en dessous du site actif, FKS1 a une poche formée dans la membrane (Fig. 3a). Il est bordé par TM5–8, TM11–12 et IF1 (Fig. 4a). TM5–8 et TM11–12 de FKS1 font partie du noyau de pli de type cellulose-synthase et correspondent à TM3–8 formant la voie de translocation de la cellulose dans BcsA36 (Fig. 2j, k). Du côté extracellulaire opposé à cette poche, il existe une autre poche exposée au solvant avec une densité de détergent beaucoup plus faible qui est directement visible sur la carte EM (Fig. 4b). La deuxième poche est formée parce que les TM9–10 et TM12 exposés à la membrane sont courts. Les deux poches hydrophiles juxtaposées avec le plan membranaire conduisent à un amincissement notable de la membrane (Fig. 4a,b), ce qui pourrait réduire considérablement la barrière énergétique pour la translocation des glucanes à travers les membranes, comme cela a été proposé pour plusieurs translocases membranaires39. En effet, les mutations de résidus le long de cette voie dans FKS1 ont altéré la fonction de FKS1 (Fig. 4c, d). Par exemple, deux résidus conservés (F1297 et H1298) sont situés entre le site actif et l'entrée cytosolique. Leurs substitutions d'alanine ont altéré la fonction de FKS1, suggérant qu'elles pourraient être impliquées dans le guidage des glucanes. En revanche, lors du remplacement de deux résidus aromatiques volumineux conservés scellant la sortie extracellulaire (F1311 et F1475) avec de l'alanine, les souches mutantes se sont développées plus rapidement que la souche WT. Nous avons pu purifier FKS1 (F1475A) et il a présenté une activité catalytique in vitro accrue et une sensibilité réduite à la caspofungine, un inhibiteur de FKS1 (Fig. 4d), ce qui implique l'élargissement de F1475A à la sortie du glucane.

a, Chemin de translocation du glucane putatif à travers deux poches membranaires, comme illustré par le réseau hexagonal. La première poche (dans la vue de surface ombrée interne), bordée par TM5–12, est située sous le site actif (ovale en pointillés verts). Les résidus conservés impliqués dans le guidage de l'entrée (H1298 et F1297) et l'obturation de la sortie (F1311 et F1475) sont étiquetés. Du côté extracellulaire, une deuxième poche se forme car les TM9–10 et TM12 exposés à la membrane sont trop courts (moins de 28 Å) pour couvrir toute la membrane. b, la carte de densité EM non affinée montre la dépression du détergent à proximité du chemin de translocation du glucane. Ce chemin est marqué par la boîte blanche en pointillés, avec les flèches indiquant l'entrée et la sortie putatives. La densité du détergent est en gris. L'épaisseur estimée de la membrane est étiquetée. L'encart montre la vue extracellulaire de la région encadrée par la ligne orange. c, Essai fonctionnel in vivo de FKS1 avec des mutations sélectionnées autour de la voie de translocation du glucane. La croissance des souches indiquées pendant 48 h a été analysée sans (à gauche) et avec (à droite) l'inhibiteur spécifique de FKS2 FK506. d, Activités FKS1 in vitro du WT et du mutant F1475A purifiés avec CHAPS, avec ou sans le CFN inhibiteur de FKS1. Les activités ont été normalisées à la quantité de protéines. Les données sont moyennes ± sem ; n = 3 expériences indépendantes. e, La structure de FKS1 (S643P) montre une densité allongée (maille bleue) dans la première poche de membrane (comme indiqué en a) pour la translocation du produit. Cette structure a été déterminée en présence d'UDP-Glc pour synthétiser le produit, qui a été stimulé par le CFN. Les hélices TM sont désignées par des nombres. L'encart montre la vue agrandie d'une chaîne de glucane modélisée de 4-glucose (bâton jaune) superposée avec sa densité correspondante (maille bleue). f, Résidus potentiels impliqués dans l'interaction glucane.

Nous avons ensuite déterminé la structure du mutant hyperactif FKS1 (S643P) purifié par GDN lorsqu'il est incubé avec UDP-Glc et caspofungine, à la résolution de 3,5 Å (Extended Data Fig. 7), dans l'espoir de capturer le substrat lié ou lié au produit. état de l'enzyme. Bien que la structure de FKS1 (S643P) ne montre pas de grandes différences de conformation par rapport à celle de WT FKS1 (écart quadratique moyen d'environ 0,7 Å), nous avons remarqué une densité allongée le long du canal de translocation de produit proposé, correspondant vraisemblablement à une limite produit (Fig. 4e). Nous avons modélisé une chaîne glucane de 4-glucose dans cette densité (Fig. 4e, encart). Une série de résidus hydrophiles et hydrophobes de FKS1 sont alignés le long de la chaîne de glucane modélisée pour des interactions enzyme-produit favorables (Fig. 4f). Le canal de translocation reste fermé du côté extracellulaire, suggérant l'existence d'un mécanisme d'ouverture de canal régulé, comme cela a été récemment proposé pour HAS34.

Nous avons d'abord évalué notre système de dosage basé sur S. cerevisiae pour l'analyse de la résistance aux échinocandines. Nous avons sélectionné les deux mutations les plus fréquemment observées chez C. albicans résistant aux médicaments (CaFKS1 F641S et S645P)28 et les avons introduites dans les sites correspondants de S. cerevisiae FKS1 (ScFKS1 F639S et S643P). Les deux souches mutantes présentaient une résistance très élevée à la caspofungine (données étendues Fig. 8a). Nous avons ensuite purifié ces deux ScFKS1 mutés dans CHAPS et évalué leur inhibition par la caspofungine (Fig. 5a). Le WT ScFKS1 en tant que contrôle présentait un profil inhibiteur typique, avec une IC50 déterminée à 0,55 µM, comparable à celle déterminée précédemment avec différentes méthodes23,25. En revanche, ScFKS1(F639S) et ScFKS1(S643P) sont insensibles à l'inhibition par la caspofungine.

a, profils d'inhibition du CFN des variants de FKS1 purifiés avec CHAPS, y compris WT FKS1 et les deux mutations résistantes à l'échinocandine les plus fréquemment observées : F639S et S643P. Le pourcentage d'activité résiduelle est indiqué. Les données sont moyennes ± sem ; n = 3 expériences indépendantes. b, trois régions de points chauds (rouges ; désignées par HS1–3) avec des mutations résistantes à l'échinocandine sont cartographiées sur la structure FKS1. Les régions hotspot sont localisées sur un cluster de trois hélices TM voisines : TM5, TM8 et TM6, respectivement. Le pli de type cellulose-synthase conservé dans FKS1 est mis en évidence dans la représentation de bande dessinée, tandis que la partie restante est dans la représentation de ruban. Ce pli conservé est entouré de lipides ordonnés représentés par des bâtonnets jaunes. La ligne pointillée indique une région désordonnée. c, Vue rapprochée des mutations résistantes aux échinocandines comme indiqué en b. Un site de mutation résistant à ibrexafungerp (A1369) en dehors de ces régions de points chauds est également montré. Les atomes Cα des mutations sont désignés par des sphères rouges. Les régions de points chauds sont enrichies en lipides ordonnés, avec des densités lipidiques sélectionnées indiquées dans un maillage gris. d, changements conformationnels et arrangements lipidiques (indiqués par des flèches rouges) autour de la région HS1 en raison de l'introduction de FKS1 (S643P), la mutation résistante aux médicaments. Ceci est illustré par la superposition de la structure FKS1 (gris) et de la structure FKS1(S643P) (bleu). La ligne pointillée noire indique une interaction polaire potentielle.

Ensuite, nous avons étudié la base mécaniste possible de la résistance aux échinocandines en utilisant la structure FKS1. Selon leurs emplacements, les mutations résistantes aux échinocandines ont été classées en trois régions conservées, englobant les résidus 639–647 dans TM5 (hotspot 1), 1354–1357 dans TM8 (hotspot 2) et 690–700 dans TM6 (hotspot 3) (les résidus sont numéroté comme dans ScFKS1) 20,22,40 (Fig. 2 supplémentaire). Bien que séparés dans la séquence primaire, trois points chauds de mutation sont spatialement proches les uns des autres (Fig. 5b, c). Dans les isolats de C. glabrata résistants à ibrexafungerp, de nouveaux sites de mutation en dehors des points chauds FKS2 1 et 2 ont été signalés (par exemple, CgFKS2 W715L et A1390D)41 ; ces sites de mutation correspondent à W695 dans le hotspot 3 de ScFKS1 et A1369 sur TM8 adjacent au hotspot 3, respectivement (Fig. 5c). Cette analyse suggère un chevauchement des sites de liaison FKS entre l'échinocandine et l'ibrexafungerp41. Ces régions de points chauds résistantes aux médicaments semblent être étroitement liées à l'environnement membranaire. Toutes les mutations résistantes aux échinocandines de FKS1 sont cartographiées près de la surface hydrophobe convexe formée par TM5–6 et TM8 et sont spécifiquement entourées de plusieurs molécules lipidiques ordonnées (Figs. 2c et 5c). F639 et S643 de la région hotspot 1 sont impliqués dans la liaison lipidique ; la chaîne latérale de F639 interagit directement avec trois molécules lipidiques et la chaîne latérale de S643 semble fixer la chaîne principale du résidu interagissant avec les lipides Y638 (Fig. 5d). De plus, nous avons analysé la structure de FKS1 (S643P) (Extended Data Fig. 7), en nous concentrant sur les altérations de la liaison lipidique induites par la mutation (Fig. 5d). Plusieurs résidus hotspot 1 près des lipides enrichis montrent une conformation altérée ; Y638 a sa chaîne latérale tournée d'environ 90 °, la chaîne latérale F639 tournant dans le même sens. Remarquablement, ces changements conduisent à des changements de lipides liés à proximité, ce qui suggère qu'un environnement lipidique altéré résulte de la mutation S643P.

Sur la base de nos résultats, nous proposons deux mécanismes possibles de résistance aux médicaments pour FKS1. Premièrement, comme les médicaments de type échinocandine sont des lipopeptides avec des queues lipidiques configurées différemment19 (données étendues Fig. 8b, c), le modèle de regroupement des mutations résistantes aux échinocandines suggère un site de liaison possible pour ces médicaments, et les liaisons peuvent impliquer leur lipide queues (Fig. 5b,c). La résistance aux médicaments peut donc être attribuée à des altérations du site de liaison aux médicaments résultant des mutations. Deuxièmement, compte tenu des lipides ordonnés enrichis près des régions de points chauds résistants aux médicaments et des mouvements lipidiques révélés à partir de la structure de FKS1 (S643P) (Fig. 5c, d), il est concevable que les mutations résistantes aux médicaments puissent altérer la réponse de FKS1 à modifications membranaires causées par l'échinocandine. Un tel mécanisme a été proposé pour les antibiotiques daptomycine et polymyxines, qui sont également des médicaments lipopeptidiques et agissant sur la membrane42,43. De manière constante, il a été rapporté que des microdomaines membranaires spécifiques sont associés à la synthèse de β-1,3-glucane44,45. De plus, il a été démontré que les changements dans le microenvironnement lipidique sont en corrélation avec l'action de l'échinocandine sur FKS46,47.

Nos travaux révèlent l'architecture moléculaire de la glucane synthase fongique FKS1. Les structures de FKS1, ainsi que des caractérisations fonctionnelles approfondies, font progresser notre compréhension mécaniste de la synthèse des β-1,3-glucanes de la paroi cellulaire fongique. L'analyse basée sur la structure des mutations résistantes aux échinocandines et la structure du mutant S643P suggèrent un mécanisme plausible de résistance aux médicaments des mutations FKS1. Ces informations peuvent également être partagées par divers agents pathogènes fongiques car leurs orthologues FKS sont hautement conservés (données étendues Fig. 9 et Fig. 2 supplémentaire). Les structures de FKS1 et le mécanisme catalytique élucidés dans ce travail peuvent servir de cadre pour de futures études sur cette importante cible médicamenteuse antifongique, ainsi que pour le criblage et le développement de nouveaux agents antifongiques.

Une étiquette 3 × Flag a été conçue pour l'extrémité C-terminale du FKS1 chromosomique sur la souche BY4742 de S. cerevisiae, à l'aide d'une méthode de marquage basée sur la PCR48. Une souche de levure avec la mutation chromosomique FKS1(S643P) a été générée en utilisant la méthode de recombinaison homologue49. Pour l'analyse cryo-EM et la synthèse du produit, FKS1 et le mutant FKS1 (S643P) ont été purifiés avec un détergent GDN comme décrit ci-dessous. Les souches ont été cultivées dans du milieu YPD à 30 °C pendant 20 h. Les cellules ont été recueillies par centrifugation et lysées par French Press dans un tampon de lyse contenant du Tris-HCl 50 mM pH 7,4, du NaCl 150 mM et du MgCl2 2 mM additionné de fluorure de phénylméthane sulfonyl (PMSF) 1 mM. Le lysat a été centrifugé à 15 000 g pendant 30 min. Le surnageant a été soumis à une ultracentrifugation à 100 000 g pendant 1 h. Le culot membranaire collecté a été solubilisé dans du tampon Tris-HCl 50 mM pH 7,4, NaCl 500 mM, MgCl2 2 mM, 10 % (v/v) glycérol, 1,5 % (p/v) n-dodécyl-β-d-maltopyranoside ( DDM ; Anatrace), sel Tris d'hémisuccinate de cholestérol à 0,15 % (CHS ; Anatrace) et inhibiteur de protéase (cOmplete protease inhibit cocktail ; Roche) par agitation douce pendant 2 h. Le surnageant a été recueilli par centrifugation à 15 000 g pendant 0,5 h et a été appliqué sur un gel d'affinité Anti-Flag M2 (Sigma). Le gel a ensuite été lavé avec un tampon de lavage contenant 50 mM de Tris-HCl pH 7,4, 150 mM de NaCl, 2 mM de MgCl2 et 0,04 % de GDN (Anatrace). Les protéines cibles ont été éluées avec un tampon de lavage additionné de 150 μg ml-1 de peptide Flag 3x. L'éluat a été concentré et purifié davantage par chromatographie d'exclusion stérique (colonne Superose 6 10/300 GL, GE Healthcare) avec un tampon contenant 50 mM de Tris-HCl pH 7,4, 150 mM de NaCl, 2 mM de MgCl2 et 0,04 % de GDN (Anatrace). Les fractions centrales du pic monodispersé ont été collectées et concentrées pour la préparation de la grille cryo-EM et la synthèse du produit.

La construction vectorielle de S. cerevisiae Rho1 étiqueté N-terminal 6 × His-SUMO a été transformée en Escherichia coli BL21 (DE3). Les souches ont été cultivées dans du milieu LB additionné de 100 µg ml-1 d'ampicilline à 37 °C jusqu'à ce que la DO600 atteigne environ 0,6. L'expression des protéines a été induite avec 0, 5 mM d'isopropyl-β-d-1-thiogalactopyranoside à 18 ° C pendant 20 h. Les bactéries collectées ont été remises en suspension et lysées par French Press dans du tampon A contenant du Tris-HCl 50 mM pH 7,4, du NaCl 300 mM et du MgCl2 2 mM. Après centrifugation, la protéine a été purifiée du surnageant par chromatographie d'affinité nickel-acide nitrilotriacétique (Ni-NTA). Lors de la dialyse dans le tampon A, une protéase Ulp1 marquée par His 6 × à un rapport Ulp1:Rho1 (p/p) de 1: 200 a été ajoutée pour éliminer l'étiquette 6 × His-SUMO. L'étiquette 6 × His-SUMO clivée et la protéase ont été éliminées par une autre analyse de chromatographie d'affinité Ni – NTA, et le flux a été collecté, concentré et soumis à une chromatographie de filtration sur gel (Superdex 200, GE Healthcare) dans un tampon contenant Tris-HCl 50 mM pH 7,4, NaCl 150 mM et MgCl2 2 mM. Les fractions centrales du pic monodispersé à 15,6 ml ont été collectées et concentrées à 10 mg ml-1.

Pour l'analyse cryo-EM à une seule particule, une aliquote de 3 µl de FKS1 purifié à une concentration de 5 mg ml-1 a ​​été appliquée sur des grilles de carbone Quantifoil à décharge luminescente (R1, 2 / 1, 3 Au, 300 mesh). Les grilles ont été buvardées pendant 4 s à 100% d'humidité et congelées instantanément dans de l'éthane liquide à l'aide de FEI Vitrobot IV. Pour l'échantillon FKS1(S643P) incubé avec UDP-Glc, FKS1(S643P) purifié dans GDN (7 mg ml-1) a été mélangé avec UDP-Glc (0,5 mM), additionné de 0,7 mg ml-1 Rho1, 10 μM GTPγS , caspofungine 200 μM, CHAPS 0,1 % et CHS 0,02 %. Le mélange a été incubé à 16 ° C pendant 2 h avant de congeler les grilles cryo-EM. Les données Cryo-EM ont été collectées sur une microscopie électronique FEI Titan Krios fonctionnant à 300 kV équipée d'une caméra Gatan K3 Summit positionnée après un filtre à énergie quantique GIF. L'acquisition automatisée des données a été réalisée avec SerialEM ou FEI EPU. Les micrographies ont été enregistrées en mode de comptage super-résolution à un grossissement nominal de × 130 000, dans une taille de pixel physique de 0, 92 Å par pixel. Les valeurs de défocalisation variaient de -1,2 μm à -3 μm. Une exposition totale de 1,3 s a été fractionnée en 32 images, ce qui a donné une dose totale accumulée de 50 e− par Å2.

Les films dose-fractionnés enregistrés ont d'abord été alignés et pondérés en fonction de la dose avec MotionCor2 (réf. 50). CTFFIND4 a ensuite été utilisé pour déterminer les paramètres de la fonction de transfert de contraste pour les micrographies individuelles51. Les micrographies de mauvaise qualité révélées par une inspection manuelle ont été exclues des analyses ultérieures. Les étapes de traitement d'image suivantes ont été effectuées à l'aide de RELION-3 (réf. 52).

Pour l'ensemble de données FKS1, un ensemble de 2 000 particules a été sélectionné manuellement pour générer des modèles de classe 2D pour la sélection automatique de particules basée sur des références. La sélection automatique a donné 2 321 905 particules à partir de 11 606 micrographies. Deux cycles de classification 2D sans référence ont été effectués pour éliminer les particules de mauvaise qualité, résultant en un ensemble nettoyé de 1 335 014 particules. Une carte ab initio a été générée avec RELION et a été utilisée comme modèle de référence initial pour une classification 3D ultérieure. Après trois cycles de classification 3D, une classe 3D avec des caractéristiques à haute résolution (267 574 particules) a été sélectionnée. Le polissage ultérieur des particules, le raffinement 3D et le post-traitement ont généré une carte avec une résolution globale de 3,4 Å.

Pour l'ensemble de données FKS1 (S643P), un ensemble d'environ 2 000 particules a été sélectionné manuellement pour générer des modèles de classe 2D pour la sélection automatique de particules basée sur des références. La sélection automatique a donné 2 222 315 particules à partir de 9 623 micrographies. Deux cycles de classification 2D sans référence ont été effectués pour éliminer les particules de mauvaise qualité, résultant en un ensemble nettoyé de 1 620 308 particules. Le modèle FKS1 a été utilisé comme modèle de référence initial pour une classification 3D plus poussée. Une classe 3D avec des caractéristiques à haute résolution (690 251 particules) a été sélectionnée. Le polissage ultérieur des particules, le raffinement 3D et le post-traitement ont généré une carte avec une résolution globale de 3,6 Å. Cette reconstruction a révélé une densité de fragments dans le canal de translocation du produit, indiquant un état mixte avec ou sans produit lié. Par conséquent, nous avons effectué une série supplémentaire de classification 3D focalisée sans réalignement des particules, en utilisant un masque focalisé autour de TM7–12 et du site actif qui entoure le canal de translocation. Une classe 3D avec les caractéristiques de résolution les plus élevées (176 682 particules) a été sélectionnée. Les particules sélectionnées ont été ré-extraites pour un raffinement 3D avec un masque complet et un post-traitement ultérieur. Cela a généré une carte avec une résolution globale de 3,5 Å, qui a été utilisée pour construire le modèle FKS1(S643P).

Les résolutions globales ont été estimées sur la base du critère de corrélation de la coquille de Fourier étalon-or 0,14353. La distribution de la résolution locale a été estimée à l'aide de ResMap54.

Un modèle initial approximatif de FKS1 a été généré de novo à l'aide du module map_to_model dans PHENIX55. Il a été encore amélioré par des ajustements manuels et une reconstruction à l'aide de Coot56, ce qui a été facilité par les bonnes densités autour des hélices TM et les densités volumineuses autour des résidus tels que Trp, Tyr, Phe et Arg. Le raffinement du modèle FKS1 par rapport à la carte cryo-EM dans l'espace réel a été réalisé dans PHENIX avec des contraintes de structure et de géométrie secondaires55. Dans le modèle FKS1 final, il existe plusieurs régions non structurées, y compris les 145 résidus N-terminaux, les 16 résidus C-terminaux, six segments flexibles du domaine cytoplasmique (résidus 244–278, 475–487, 798–805, 897–931, 1159 –1167 et 1247–1266) et quatre segments de boucle pour connecter les hélices TM (résidus 1419–1435, 1516–1554, 1627–1637 et 1698–1723). Le modèle de FKS1 (S643P) a été construit sur la base du modèle de FKS1. MOLPROBITY a été utilisé pour évaluer le modèle final57. La corrélation en coquille de Fourier entre le modèle et la carte a été calculée par PHENIX.mtriage58. La recherche de structure homologue a été effectuée à l'aide du serveur DALI59. Pour la comparaison structurelle avec FKS1, la structure modélisée par AlphaFold de la curdlan synthase a été utilisée60,61. Les figures illustrées ont été préparées en utilisant PyMOL (Schrödinger, LLC), Chimera et ChimeraX62,63. Les statistiques des reconstructions 3D et des raffinements du modèle sont présentées dans le tableau de données étendu 1.

Des souches de levure avec des mutations chromosomiques FKS1 et la souche FKS1-KO ont été générées en utilisant la méthode de recombinaison homologue49. Les mutants ont été sélectionnés sur SD-His (Yeast Synthetic Drop-out Medium without Histidine, cat no. S0020, Solarbio) et ont été confirmés par PCR génomique et séquençage d'ADN. Pour l'analyse du phénotype de croissance, le test de croissance ponctuelle des souches mutées a été adapté d'une méthode décrite précédemment24. Les souches ont été cultivées dans du milieu YPD à 30 ° C à 200 tr / min jusqu'à la phase exponentielle jusqu'à ce que la DO600 soit de 0, 8. Les cellules ont été diluées à une DO6oo de 0,1. Ensuite, des portions de 5 μl de dilutions au 1/10 des souches indiquées ont été déposées sur SD-His avec ou sans FK506 (1 μg ml-1). Après incubation à 30 °C pendant le temps indiqué, les plaques ont été photographiées avec le système d'image 5200CE (TANON). Chaque test a été répété trois fois avec des résultats similaires.

Pour profiler la croissance cellulaire, la souche WT et la souche FKS1-KO ont été cultivées dans un milieu YPD à 30 ° C pendant la nuit jusqu'à la phase exponentielle. Ensuite, les cellules cultivées ont été inoculées dans le milieu YPD frais avec une DO600 initiale de 0, 01, qui a été complétée avec ou sans 1 μg ml-1 FK506. Les nouvelles cultures ont ensuite été cultivées à 30 ° C jusqu'à la phase stationnaire. Au cours de la culture, les densités optiques (DO600) ont été mesurées à 8 h d'intervalle pendant 48 h. Les expériences ont été faites en triple pour faire les courbes de croissance cellulaire.

Les souches de levure portant différents variants de FKS1 avec l'étiquette C-terminale 3x Flag ont été générées, cultivées et lysées comme décrit ci-dessus. La membrane collectée a été solubilisée dans un tampon contenant du Tris-HCl 50 mM pH 7,4, de l'EDTA 1 mM, du glycérol 33 %, du CHAPS 0,5 % (Anatrace), du CHS 0,1 % (Anatrace), du GTPγS 4 µM et de l'inhibiteur de protéase (cocktail d'inhibiteurs de protéase cOmplete, Roche). FKS1 et ses variants ont été purifiés à l'aide d'un gel d'affinité anti-Flag M2 (Sigma) et ont été élués dans un tampon contenant 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 1 mM EDTA, 33% glycérol, 0,2% CHAPS et 0,04% CHS, additionné de 150 μg ml-1 3x peptide drapeau. Les protéines purifiées dans du détergent CHAPS ou GDN ont été dosées en utilisant le kit UDP-Glo ​​Glycosyltransferase Assay (Promega) pour contrôler l'UDP libéré. Parmi les variantes de FKS, 2,5 µl ont été ajoutés à 30 µl de mélange réactionnel au total contenant 50 mM de Tris-HCl pH 7,4, 33 % de glycérol, 1 mM d'EDTA, 6 µg ml-1 Rho1, 0,2 % CHAPS, 0,04 % CHS, 4 µM GTPγS et 20 mM de fluorure de potassium (KF). La réaction a été initiée en ajoutant de l'UDP-Glc à une concentration finale de 2,5 mM. La réaction a été effectuée à 30°C pendant 1 h. La luminescence a été enregistrée à l'aide d'un système Pherastar FS (BMG Labtech). L'activité finale a été normalisée à la quantité de FKS1 qui a été mesurée par immunotransfert contre l'étiquette 3 × Flag, en utilisant l'anticorps monoclonal de l'étiquette DYKDDDDK (dilution 1: 1 000; cat n° 66008-3-Ig, clone n° 2B3C4, Proteintech). Dans le cas du profilage des inhibiteurs, des dilutions en série de médicaments à base d'échinocandines ont d'abord été incubées avec des variants de FKS1 pendant 10 min à température ambiante avant d'ajouter d'autres composants pour réagir.

Pour la synthèse in vitro de β-1,3-glucane, l'enzyme purifiée dans le détergent GDN (FKS1 ou le mutant FKS1(S643P) ; 0,02 mg ml-1) et l'UDP-Glc donneur (2,5 mM) ont été mélangés dans un tampon de réaction (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 33% glycérol, 1 mM EDTA, 6 μg ml-1 Rho1, 0,2% CHAPS, 0,04% CHS, 4 μM GTPγS et 20 mM KF), en présence ou non de 200 μM de caspofongine. Le volume de réaction a été établi à 100 ul (pour la coloration au bleu d'aniline) ou à 10 ml (pour l'enrichissement du produit et la dégradation enzymatique ultérieure et l'analyse de la liaison glycosyle). La réaction a été effectuée à 30°C pendant la durée indiquée.

Pour la coloration des produits synthétisés par le bleu d'aniline, une aliquote de 100 μl de réactifs ou 0,1 % (p/v) de β-glucane de S. cerevisiae (Sigma) a été prélevée et ajoutée à volume égal de bleu d'aniline (0,03 % ; Sigma ). Le mélange a été incubé dans l'obscurité pendant 20 minutes pour une liaison complète du colorant. Chaque échantillon a ensuite été chargé dans un capillaire et a été observé au microscope à fluorescence avec une longueur d'onde d'excitation de 365 nm et une longueur d'onde d'émission de 433 nm. Chaque test a été répété trois fois avec des résultats similaires.

Le polymère synthétisé in vitro est insoluble dans l'eau et a été recueilli par centrifugation. Il a été lavé deux fois avec du tampon : Tris-HCl 50 mM pH 7,4, glycérol 33 %, EDTA 1 mM, CHAPS 0,2 %, CHS 0,04 %, KF 20 mM et deux fois avec de l'eau déminéralisée. Deux enzymes ont été utilisées pour l'analyse de la dégradation du polymère synthétisé : endo-β-1,3-glucanase (Trichoderma sp. ; code produit : E-LAMSE, Megazyme) ou endo-β-1,4-glucanase (Aspergillus niger ; code produit : E-CELAN, Megazyme). Ces deux enzymes ont d'abord été dialysées dans le tampon (NaAc 100 mM pH 4,5). Ensuite, 0,5 U de chaque enzyme a été ajoutée à 50 ul de 1 % (p/v) de polymère synthétisé dans du NaAc 200 mM (pH 4,5). La dégradation des témoins standards cellulose (C6288, Sigma) ou curdlan (C7821, Sigma) a également été réalisée dans les mêmes conditions64,65. Les mélanges ont été incubés à 40 ° C et des échantillons ont été prélevés à divers intervalles de temps et bouillis pendant 5 minutes pour terminer la réaction. Les produits de dégradation enzymatique ont ensuite été analysés par chromatographie sur couche mince. En bref, une aliquote de 2 µl des échantillons prélevés a été déposée sur une plaque de gel de silice (Merck Silica gel 60 F254) et développée dans un système de solvant contenant du n-butanol:acide acétique:eau (2:1:1 v/v/ v). Les plaques ont été visualisées par immersion dans du méthanol : acide sulfurique (95 : 5 v/v) et chauffage ultérieur à 95 °C. Un mélange de glucose (G5767, Sigma), de laminaribiose (O-LAM2, Megazyme), de laminaritriose (O-LAM3, Megazyme) et de laminarihexaose (O-LAM6, Megazyme) a été utilisé comme étalon de chromatographie en couche mince.

Lors de la digestion enzymatique du polymère synthétisé, les sucres réducteurs libérés ont été mesurés à l'aide des réactifs DNS (Micro Reducing Sugar Assay Kit, Abbkine). En bref, 175 μl de l'échantillon d'hydrolyse dilué ont été mélangés avec 125 μl de réactif DNS. L'étalon du kit à la plage de concentration de 0,2 à 0,6 mg ml-1 a ​​été utilisé pour la génération de la courbe standard. Les mélanges réactionnels ont été bouillis dans un bain-marie pendant 5 min. Après refroidissement à température ambiante dans un bain eau-glace, l'absorbance d'un échantillon de 0,2 ml a été mesurée à 540 nm.

Le polymère synthétisé in vitro par FKS1 a été lavé deux fois avec un tampon : 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 33 % de glycérol, 1 mM EDTA, 0,2 % CHAPS, 0,04 % CHS, 20 mM KF et deux fois avec de l'eau déminéralisée. L'échantillon lavé a ensuite été dialysé dans de l'eau déminéralisée et lyophilisé. Une analyse de méthylation a été réalisée suite à une étude précédente66. L'échantillon séché (environ 1 mg) a été dissous dans du DMSO (500 µl). La méthylation a été effectuée dans du DMSO/NaOH avec de l'iodométhane pendant 1 h. Les produits méthylés ont été hydrolysés avec de l'acide trifluoroacétique 2 M à 121 ° C pendant 90 min, réduits par NaBD4 et acétylés avec de l'anhydride acétique à 100 ° C pendant 2,5 h. Les acétates d'alditol partiellement méthylés résultants ont été analysés à l'aide du système GC-MS (6890A-5975C, Agilent Technology) équipé d'une colonne chromatographique Agilent BPX70 (30 m × 0,25 mm × 0,25 µm; SGE). Le programme de température a été défini comme suit : 140 °C pendant 2 min, 140–230 °C à 3 °C par minute et 230 °C pendant 3 min.

Les niveaux de β-1,3-glucane ont été déterminés à l'aide du dosage au bleu d'aniline, comme décrit précédemment23,26,67,68,69,70,71,72. Les souches de test ont été cultivées dans des milieux YPD jusqu'à la phase exponentielle jusqu'à ce que la DO600 soit de 0,5. La même quantité de cellules pour chaque souche a été recueillie par centrifugation à 5 000 g. Les cellules collectées ont été lavées deux fois avec du tampon TE (Tris-HCl 10 mM pH 8,0 et EDTA 1 mM). Les cellules culottées ont été mises en suspension avec 0,5 ml de tampon TE et mélangées avec 0,1 ml de NaOH 6 M. Le mélange a été incubé dans un bain-marie à 80 ° C pendant 30 minutes pour solubiliser le glucane. Ensuite, 2,1 ml de bleu d'aniline (bleu d'aniline 0,03 %, HCl 0,18 M et glycine-NaOH 0,49 M pH 9,5) ont été ajoutés à chaque échantillon. Les échantillons ont été brièvement vortexés et incubés à 50 °C pendant 30 min et 30 min supplémentaires à 24 °C. La fluorescence a été quantifiée à l'aide d'un lecteur de plaques à fluorescence (CLARIOstar Plus, BMG Labtech) sous une longueur d'onde d'excitation de 400 nm et une longueur d'onde d'émission de 460 nm avec une coupure de 455 nm. Tous les échantillons ont été mesurés en triple.

Les échantillons de protéines ont été séparés par un gel SDS-PAGE et ont été colorés au Coomassie. La bande de gel a été excisée manuellement et décolorée. Les protéines ont été réduites avec du DTT, alkylées avec de l'IAA et digérées avec de la trypsine de qualité protéomique dans du bicarbonate d'ammonium 20 mM73. La digestion a été effectuée pendant une nuit à 37°C et arrêtée en ajoutant 2% d'acide formique. Les peptides en gel ont été extraits en utilisant une solution contenant 2 % d'acide formique et 67 % d'acétonitrile. Les peptides ont été séchés sous vide, remis en suspension dans de l'acide formique à 0,1 %, chargés sur la colonne piège nanoViper C18 (3 μm, 100 Å) et séparés sur une colonne analytique (Acclaim PepMap RSLC, 75 μm × 25 cm ; C18 2 μm, 100 Å) en utilisant le système HPLC EASY nLC 1200 (Thermo Fisher). Le gradient d'élution était de 5 à 38 % de tampon A (0,1 % d'acide formique et 80 % d'acétonitrile) sur 30 min. L'analyse par spectrométrie de masse a été réalisée sur un spectromètre de masse Q Exactive (Thermo Fisher). Les données résultantes ont été converties en fichier mgf avec ProteoWizard et analysées à l'aide du moteur de recherche Mascot pour l'identification des protéines par rapport à une base de données UniProt Saccharomyces cerevisiae avec un taux de fausse découverte inférieur à 1 %.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les cartes de densité EM ont été déposées dans la banque de données de microscopie électronique sous les codes d'accession EMD-33154 (FKS1) et EMD-34115 (FKS1(S643P)). Les coordonnées ont été déposées dans l'APB sous les codes d'accession 7XE4 (FKS1) et 7YUY (FKS1(S643P)). Cette étude a analysé plusieurs structures protéiques accessibles au public auprès de la PDB sous les codes d'accession 4HG6, 6WLB, 7SP7, 6YV8, 6iwr, 6h4m et 1qgq.

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Nous remercions tous les membres du personnel du Cryo-EM Center, Southern University of Science and Technology pour leur aide dans la collecte de données ; et J. Zhao pour des conseils sur la chromatographie en couche mince. Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (92053112 et 31971148 à HY, 32100575 à Min Zhang et 82188101 à Mingjie Zhang), ShenZhen Talent Program KQTD20210811090115021 (à Mingjie Zhang et XL), les fonds de recherche fondamentale pour les universités centrales (5003510056 à HY et 5003510112 à Min Zhang) et Programme de l'équipe HUST Academic Frontier Youth (2018QYTD02 à HY).

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Xinlin Hu, Ping Yang

Département de biochimie et de biologie moléculaire, École de médecine fondamentale, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan, Chine

Xinlin Hu, Ping Yang, Changdong Chai, Jia Liu, Huanhuan Sun, Yanan Wu, Min Zhang et Hongjun Yu

Département de biologie des agents pathogènes, École de médecine fondamentale, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan, Chine

Xinlin Hu, Jia Liu et Min Zhang

École des sciences de la vie, Université des sciences et technologies du Sud, Shenzhen, Chine

Mingjie Zhang et Xiaotian Liu

Innocenter biomédical de la grande baie, laboratoire de la baie de Shenzhen, Shenzhen, Chine

Mingjie Zhang

Centre de recherche sur l'architecture cellulaire, Université des sciences et technologies de Huazhong, Wuhan, Chine

Hongjun Yu

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XH, PY, Min Zhang, XL et HY ont préparé l'échantillon, collecté les données et résolu les structures. XH, PY et Min Zhang ont réalisé les expériences fonctionnelles, assistés de CC, JL, HS et YW Mingjie Zhang, Min Zhang, XL et HY ont conçu les expériences, analysé les données et rédigé le manuscrit.

Correspondance avec Min Zhang, Xiaotian Liu ou Hongjun Yu.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature remercie Vincent Bulone et le(s) autre(s) relecteur(s) anonyme(s) pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

a, Profil d'élution de la chromatographie par filtration sur gel (Superose 6 Augmentation 10/300 GL) de FKS1 purifié dans du détergent GDN. La boîte en pointillés verts marque les fractions regroupées pour l'analyse cryoEM. b, analyse SDS-PAGE (gauche) et western blot (droite) des fractions du pic d'élution monodisperse en (a). Un gel représentatif et une image western-blot parmi 3 répétitions sont présentés. c, Profil d'élution de la Chromatographie par filtration sur gel (Superose 6 Augmentation 10/300 GL) de FKS1 S643 purifié dans du détergent GDN. La boîte en pointillés verts marque les fractions regroupées pour l'analyse cryoEM et la synthèse du produit. d, analyse SDS-PAGE des fractions du pic d'élution monodisperse en (c). Un gel représentatif parmi 3 répétitions est montré. e, Profil d'élution de la chromatographie par filtration sur gel (Superdex 200 Augmentation 10/300 GL) de Rho1. La boîte en pointillés verts marque les fractions regroupées pour le dosage de l'activité et la synthèse du produit. f, analyse SDS-PAGE des fractions du pic d'élution monodisperse en (e). Deux pics en (e) montrent un motif à trois bandes similaire (f), et les trois bandes ont été identifiées comme Rho1 par analyse Mass Spec. Un gel représentatif parmi 3 répétitions est montré. g, analyses Western blot de FKS1 de type sauvage et de différents variants de FKS1 purifiés dans CHAPS détergent. Une image représentative parmi 3 répétitions est affichée. h, analyse SDS-PAGE de variants FKS1 à étiquette drapeau purifiés par GDN, qui ont été utilisés pour les dosages d'activité (ij) et la synthèse du produit (k). Première voie, FKS1 WT ; deuxième voie, FKS1 S643P (le mutant résistant à l'échinocandine); troisième voie, FKS1 S643P purifié est immunodéplété par des billes anti-drapeau ; quatrième voie, FKS1 S643P/K1261A. Un gel représentatif parmi 3 répétitions est montré. Pour (b, d, f, g, h), leurs analyses complètes sont fournies dans la Fig. 1 supplémentaire. i, Activité in vitro des variants de FKS1 purifiés dans GDN. L'activité a été dosée en surveillant l'UDP généré (réaction de 1 h). Les données sont moyennes ± SEM, n = 3 expériences indépendantes. j–k, Essai de synthèse de produits in vitro par des variants de FKS1 purifiés en GDN. Le dosage a été réalisé soit en colorant les produits synthétisés avec un colorant bleu d'aniline (j; réaction de 12 h) soit par visualisation des produits synthétisés (k; réaction de 48 h). Ces expériences ont été répétées trois fois avec des résultats similaires. l, spécificité du donneur de la synthèse du produit par FKS1 S643P purifié par GDN. Les polymères insolubles dans l'eau (indiqués par une flèche blanche) n'apparaissent qu'en présence d'UDP-Glc au lieu d'UDP-GlcNAc. Cette expérience a été répétée trois fois avec des résultats similaires. m, Les effets de Mg2+ sur l'activité catalytique de FKS1 S643P purifié par GDN. L'activité a été dosée en présence d'EDTA 1 mM ou de Mg2+ 200 μM. Les données sont moyennes ± SEM, n = 3 expériences indépendantes. En médaillon, synthèse du produit en présence d'EDTA 1 mM ou de Mg2+ 200 µM. Cette expérience a été répétée trois fois avec des résultats similaires.

a, Quantification des sucres réducteurs libérés lors de la digestion enzymatique du polymère insoluble dans l'eau synthétisé par FKS1 S643P purifié par GDN. Deux glucanases spécifiques ont été utilisées : l'endo-1,3-β-glucanase spécifique et l'endo-1,4-β-glucanase. Les données sont moyennes ± SEM, n = 3 expériences indépendantes. b – c, La spécificité d'hydrolyse de l'endo-1,3-β-glucanase et de l'endo-1,4-β-glucanase a été testée contre le polysaccharide standard β-1,3-glucane curdlan (b) et la cellulose (c). Un mélange de glucose (Gl), de laminaribiose (G2), de laminaritriose (G3) et de laminarihexaose (G6) a été utilisé comme standards (piste M). d, le spectre de masse du pic GC (11,64 min) dans (Fig. 1f) révèle l'identité de ce PMAA en tant que 1,3,5-tri-O-acétyl-2,4,6-tri-O-méthyl glucitol, confirmant Liaison 1,3-Glcp.

a, Une micrographie cryo-EM représentative de FKS1 à partir de 11606 micrographies collectées. b, moyennes représentatives de la classe 2D. c, organigramme de l'acquisition de données cryo-EM et du traitement des données de FKS1. Voir Méthodes pour plus de détails. d, La courbe de corrélation de coquille de Fourier (FSC) de référence de la carte reconstruite. e, La courbe FSC entre le modèle et la carte, qui est calculée par PHENIX.mtriage58. f, vues en coupe de la distribution angulaire de toutes les particules utilisées dans la reconstruction 3D finale. g, distribution de résolution locale de la carte cryo-EM finale de FKS1, calculée avec ResMap54. h, diagramme topologique du domaine FKS1 GT. Les segments flexibles invisibles dans la reconstruction 3D sont représentés par des lignes pointillées. i, Interactions entre les domaines AC et GT. Sont étiquetés les brins β centraux et les éléments structurels impliqués dans l'interface de contact étendue : α2-5, α8-11, boucles Lα9-α10 et Lα11-α12 du domaine AC ; α31, α34-35, boucles Lβ5-β6, Lβ7-β8 ; Lβ8-β9 du domaine GT). Le FKS1 R319, un résidu essentiel précédemment identifié pour FKS124, est marqué par son atome Cα en tant que sphère et est intégré dans cette interface. j, vue agrandie de la région encadrée en (i), montrant l'interaction entre R319 et N1087 pour maintenir l'interface entre les domaines AC et GT.

a, densités Cryo-EM de TM1-8, 11–17. bc, densités Cryo-EM du feuillet β central continu de 9 brins présenté dans le domaine FKS1 GT. d, densité Cryo-EM du N-glycane sur N1849. e, densités Cryo-EM du site actif. f, vue en coupe des densités cryo-EM près de TM9 et TM10. La carte est segmentée et colorée comme sur la Fig. 2a. Les densités correspondant aux hélices TM TM7-12, TM14-16 sont désignées par des nombres. Seule la chaîne principale TM9-10 peut être tracée à partir de cette carte, bien qu'elle présente des densités plus faibles que les autres hélices TM. g – h, Deux vues du modèle FKS1 avec des lipides liés. Le modèle FKS1 est coloré comme sur la Fig. 1h et les lipides ordonnés sont représentés par des sphères jaunes. Les densités cryo-EM des lipides sont illustrées dans les cases en pointillés. La position et la densité du phospholipide intégré dans le domaine transmembranaire sont indiquées dans la boîte pleine.

a, Le pli conservé de FKS1 (résidus 615–1510) a été superposé à celui de BcsA (PDB ID : 4P00; résidus 63–584), avec une valeur RMSD de 4, 3 Å sur 308 résidus alignés. BcsA est coloré en gris. Le noyau FKS1 est coloré en orange tandis que les éléments exclusifs à FKS1 dans son domaine GT sont affichés avec un code couleur, comme indiqué en (a) et (b). Les hélices TM correspondantes sont désignées par des étiquettes tandis que TM9 et TM10 sont exclusifs pour FKS1. b, Vue rapprochée des domaines GT superposés en (a). La feuille β centrale présentée dans le domaine GT gagne en extension dans FKS1. Les supports étendus β6 et β7 dans FKS1 et la boucle allongée Lβ8-β9 contribuent à une partie substantielle de l'interface d'interaction avec le domaine AC dans FKS1 (Fig. 1j). De plus, deux sous-régions spécifiques à FKS1 s'insèrent sur les deux côtés de β3, le premier brin de la feuille β centrale. La sous-région précédant β3 (résidus 719–840) contient six hélices et une paire de brins β antiparallèles (β1, β2); la sous-région résultant de β3 (résidus 848–998) est α-hélicoïdale, composée de 9 hélices. Ces deux sous-régions interagissent pour emballer la feuille β centrale d'un côté. c, Vue arrière des domaines transmembranaires superposés. d, Vue rapprochée des interfaces membrane-cytosol superposées. L'hélice d'interface IF1 est préservée dans FKS1, qui montre un réarrangement spectaculaire par rapport à celui de BcsA. L'hélice d'interface IF2 reliant un feuillet bêta et un domaine transmembranaire est préservée dans FKS1 mais désordonnée dans la structure, ce qui est également indiqué en (c). L'hélice d'interface IF3 a disparu dans FKS1 et elle est remplacée par les hélices transmembranaires TM9 et TM10 dans FKS1. e, Alignement de séquence basé sur la structure des plis conservés de type cellulose-synthase entre FKS1 et BcsA. L'alignement a d'abord été généré à l'aide de PROMALS3D, puis illustré à l'aide du serveur ESPript3. Les résidus et les motifs ayant des fonctions importantes sont étiquetés. Au-dessus et au-dessous de l'alignement se trouvent les éléments structurels secondaires dérivés de la structure FKS1 (symbole bleu) et de la structure BcsA (PDB ID : 4P00) (symbole orange), respectivement. Les symboles sont les hélices TM (barre pleine), les hélices (barre vide) et les brins β (flèche).

Les domaines catalytiques GT analysés sont superposés et présentés séparément sous forme de dessin animé. Les résidus impliqués dans la liaison au substrat ou la catalyse sont indiqués sous forme de bâtonnets. Le nucléotide lié est représenté par de fins bâtonnets magenta. Les résidus conservés sont surlignés en jaune lors de l'utilisation du site actif de la cellulose synthase bactérienne BcsA (a) comme référence. a–f, Superposition des domaines catalytiques GT des glycosyltransférases liées à la membrane : cellulose synthase bactérienne BcsA (a ; PDB ID : 4hg6), β-1,3-glucane synthase FKS1 (b), cellulose synthase végétale CesA (c ; PDB ID : 6wlb), virus hyaluronane synthase (d ; PDB ID : 7sp7), Agrobacterium curdlan synthase (e ; modèle de la base de données AlphaFold ; Uniprot ID : Q9X2V0), archaeal mannosyltransférase PcManGT (f ; PDB ID : 6YV8). Les panneaux délimités par l'encadré bleu (a – e) sont des polysaccharides synthases liés à la membrane contenant un pli de type cellulose-synthase, comme illustré à la Fig. 2f – m. PcManGT (panneau f) contient un demi-tunnel membranaire de BcsA, et il a été proposé d'avoir un pli minimal de type cellulose-synthase35. g–i, Superposition des domaines catalytiques GT des glycosyltransférases solubles : GalNAc-T7 humain (g ; PDB ID : 6iwr), S. aureus TarP (h ; PDB ID : 6h4m), B. subtilis SpsA (i ; PDB ID : 1qgq ).

a, Une micrographie cryo-EM représentative de FKS1 S643P à partir de 9623 micrographies collectées. b, moyennes représentatives de la classe 2D. c, organigramme de l'acquisition de données cryo-EM et du traitement des données de FKS1 S643P. Voir Méthodes pour plus de détails. d, La courbe de corrélation de coquille de Fourier (FSC) de référence de la carte reconstruite. e, La courbe FSC entre le modèle et la carte, qui est calculée par PHENIX.mtriage58. f, vues en coupe de la distribution angulaire de toutes les particules utilisées dans la reconstruction 3D finale. g, distribution de résolution locale de la carte cryo-EM finale de FKS1 S643P, calculée avec ResMap. h, Ajustement de la carte cryo-EM avec le modèle FKS1 S643P dans des exemples de régions.

a, Analyse du phénotype résistant à la caspofungine de la souche S. cerevisiae avec les mutations FKS1 indiquées. Les concentrations de caspofongine testées sont indiquées en haut. b, Structure chimique de quatre types de médicaments à base d'échinocandines. Ils présentent tous une queue lipidique comme le souligne la boîte. c, Structure chimique des chaînes alkyle lipidiques (panneau de gauche) et phospholipide (panneau de droite) identifiée à partir de la structure FKS1.

a—c, la structure FKS1 est colorée selon le niveau de conservation de la séquence (rouge, haut ; bleu, bas). a–b, Vue arrière et avant parallèles à la membrane, en dessin animé. c, la même vue que (b) avec représentation de surface.

Ce fichier contient les transferts non recadrés (Fig. 1 supplémentaire) et l'alignement de séquences multiples d'orthologues FKS de divers champignons pathogènes et de Saccharomyces cerevisiae (Fig. 2 supplémentaire).

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Réimpressions et autorisations

Hu, X., Yang, P., Chai, C. et al. Aperçus structurels et mécanistes de la β-1,3-glucane synthase fongique FKS1. Nature 616, 190-198 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-05856-5

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Reçu : 29 mars 2022

Accepté : 16 février 2023

Publié: 22 mars 2023

Date d'émission : 06 avril 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41586-023-05856-5

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